ئىممۇنىتېت تەڭشىگۈچ مېتابولىتلار ئۆسمە مىكرو مۇھىتىنىڭ (TME) ئاساسلىق ئالاھىدىلىكى، ئەمما بىر قىسىم ئىستىسنالاردىن باشقا، ئۇلارنىڭ كىملىكى ئاساسەن نامەلۇم. بۇ يەردە، بىز يۇقىرى دەرىجىلىك سېروز راكى (HGSC) بىمارلىرىنىڭ ئۆسمىسى ۋە ئاسسىتلىرىدىن ئۆسمە ۋە T ھۈجەيرىلىرىنى تەھلىل قىلىپ، بۇ خىل TME بۆلەكلىرىنىڭ مېتابولومىنى ئاشكارىلىدۇق. ئاسسىت ۋە ئۆسمە ھۈجەيرىلىرى مېتابولىت جەھەتتە كەڭ كۆلەمدە پەرقلىنىدۇ. ئاسسىت بىلەن سېلىشتۇرغاندا، ئۆسمىگە سىڭىپ كىرىدىغان T ھۈجەيرىلىرى 1-مېتىلنىكوتىنامىد (MNA) غا مول. T ھۈجەيرىلىرىدىكى MNA سەۋىيىسى يۇقىرى بولسىمۇ، نىكوتىنامىد N-مېتىل ترانسفېرازا (S-ئادېنوسىلمېتىئونىندىن نىكوتىنامىدقا مېتىل گۇرۇپپىسىنىڭ يۆتكىلىشىنى كاتالىزاتورلايدىغان بىر خىل ئېنزىم) نىڭ ئىپادىلىنىشى فىبروبلاست ۋە ئۆسمە ھۈجەيرىلىرى بىلەنلا چەكلىنىدۇ. ئىقتىدار جەھەتتىن، MNA T ھۈجەيرىلىرىنى ئۆسمىنى ئىلگىرى سۈرىدىغان سىتوكىن ئۆسمە نېكروز فاكتورى ئالفا نى ئاجرىتىپ چىقىرىشقا ئۈندەيدۇ. شۇڭا، TME دىن ئېلىنغان MNA T ھۈجەيرىلىرىنىڭ ئىممۇنىتېت تەڭشىشىگە تۆھپە قوشىدۇ ۋە ئىنسان راكىنى داۋالاشتا ئىممۇنىتېت داۋالاش نىشانىنى ۋەكىللىك قىلىدۇ.
ئۆسمىدىن ئېلىنغان مېتابولىتلار ئۆسمىگە قارشى ئىممۇنىتېت كۈچىگە چوڭقۇر توسقۇنلۇق قىلىش تەسىرىنى كۆرسىتىدۇ، ھەمدە بارغانسېرى كۆپ دەلىللەر ئۇلارنىڭ كېسەللىكنىڭ ئىلگىرىلىشىنىڭ مۇھىم ھەرىكەتلەندۈرگۈچ كۈچى بولۇپ خىزمەت قىلالايدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ (1). ۋاربۇرگ ئۈنۈمىدىن باشقا، يېقىندا ئۆسمە ھۈجەيرىلىرىنىڭ ماددا ئالمىشىش ھالىتى ۋە ئۇنىڭ ئۆسمە مىكرو مۇھىتى (TME) نىڭ ئىممۇنىتېت ھالىتى بىلەن بولغان مۇناسىۋىتىنى خاراكتېرلەندۈرۈشكە باشلىدى. چاشقان مودېللىرى ۋە ئىنسان T ھۈجەيرىلىرى ئۈستىدە ئېلىپ بېرىلغان تەتقىقاتلاردا، گلۇتامىن ماددا ئالمىشىشى (2)، ئوكسىدلىنىش ماددا ئالمىشىشى (3) ۋە گلۇكوزا ماددا ئالمىشىشى (4) ھەر خىل ئىممۇنىتېت ھۈجەيرىلىرىنىڭ كىچىك گۇرۇپپىلىرىغا مۇستەقىل تەسىر كۆرسىتەلەيدىغانلىقى كۆرسىتىلدى. بۇ يوللاردىكى بىر قىسىم مېتابولىتلار T ھۈجەيرىلىرىنىڭ ئۆسمىگە قارشى ئىقتىدارىنى توسىدۇ. كوئېنزىم تېتراھىدروبىئوپتېرىننىڭ (BH4) توسۇلۇشى T ھۈجەيرىلىرىنىڭ كۆپىيىشىگە زىيان يەتكۈزىدىغانلىقى، بەدەندە BH4 نىڭ كۆپىيىشى CD4 ۋە CD8 ئارقىلىق ئۆسمىگە قارشى ئىممۇنىتېت ئىنكاسىنى كۈچەيتىدىغانلىقى ئىسپاتلاندى. بۇنىڭدىن باشقا، كىنۇرېنىننىڭ ئىممۇنىتېتنى تۆۋەنلىتىش ئۈنۈمىنى BH4 نى ئىشلىتىش ئارقىلىق قۇتقۇزۇشقا بولىدۇ (5). ئىزوسىترات دېھىدروگېنازا (IDH) مۇتانتى گلىئوبلاستومىدا، ئېنانتىئومېتابولىك (R)-2-گىدروكسىگلۇتارات (R-2-HG) نىڭ ئاجرىلىپ چىقىشى T ھۈجەيرىسىنىڭ ئاكتىپلىشىشى، كۆپىيىشى ۋە سىتولىز پائالىيىتىنى چەكلەيدۇ (6). يېقىندا، گلىكولىزنىڭ قوشۇمچە مەھسۇلاتى بولغان مېتىلگلىئوكسالنىڭ مىيېلوئىد مەنبەلىك باستۇرغۇچى ھۈجەيرىلەر تەرىپىدىن ئىشلەپچىقىرىلىدىغانلىقى، مېتىلگلىئوكسالنىڭ T ھۈجەيرىسىگە يۆتكىلىشىنىڭ ئۈنۈم بېرىدىغان T ھۈجەيرىسىنىڭ ئىقتىدارىنى چەكلەيدىغانلىقى كۆرسىتىلدى. داۋالاشتا، مېتىلگلىئوكسالنىڭ نېيتراللىشىشى مىيېلوئىد مەنبەلىك باستۇرغۇچى ھۈجەيرىلەرنىڭ (MDSC) پائالىيىتىنى يېڭىپ، چاشقان مودېللىرىدىكى تەكشۈرۈش نۇقتىسى توسۇش داۋالاش ئۇسۇلىنى بىرلىكتە كۈچەيتەلەيدۇ (7). بۇ تەتقىقاتلار TME مەنبەلىك مېتابولىتلارنىڭ T ھۈجەيرىسىنىڭ ئىقتىدارى ۋە پائالىيىتىنى تەڭشەشتىكى مۇھىم رولىنى بىرلىكتە تەكىتلەيدۇ.
T ھۈجەيرىسىنىڭ ئىقتىدارىنىڭ قالايمىقانلىشىشى تۇخۇمدان راكىدا كەڭ كۆلەمدە خەۋەر قىلىنغان (8). بۇنىڭ قىسمەن سەۋەبى، ئوكسىگېن يېتىشمەسلىكى ۋە نورمالسىز ئۆسمە قان تومۇر سىستېمىسى (9) نىڭ ماددا ئالمىشىش خۇسۇسىيىتى بولۇپ، بۇ گلۇكوزا ۋە تىرىپتوفاننىڭ سۈت كىسلاتاسى ۋە كىنۇرېنىن قاتارلىق قوشۇمچە مەھسۇلاتلارغا ئايلىنىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ. ھۈجەيرە سىرتىدىكى لاكتاتنىڭ ھەددىدىن زىيادە كۆپ بولۇشى ئىنتېرفېرون-γ (IFN-γ) نىڭ ئىشلەپچىقىرىلىشىنى ئازايتىدۇ ۋە مىيېلوسوپرېسسىيەلىك كىچىك گۇرۇپپىلارنىڭ پەرقلىنىشىنى ئىلگىرى سۈرىدۇ (10، 11). تىرىپتوفاننى ئىستېمال قىلىش بىۋاسىتە T ھۈجەيرىسىنىڭ كۆپىيىشىنى توسىدۇ ۋە T ھۈجەيرىسى قوبۇللىغۇچىسىنىڭ سىگنالىنى توسىدۇ (12-14). بۇ كۆزىتىشلەرگە قارىماي، ئىممۇنىتېت ماددا ئالمىشىشىغا مۇناسىۋەتلىك نۇرغۇن خىزمەتلەر سىناق نەيچىسىدە ئەلالاشتۇرۇلغان مۇھىت ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى ياكى تىرىك جانلىقلاردا گومولوگىيەلىك چاشقان مودېللىرى بىلەنلا چەكلەندى، بۇلارنىڭ ھېچقايسىسى ئىنسان راكى ۋە فىزىئولوگىيىلىك ماكرو ۋە مىكرو مۇھىتنىڭ كۆپ خىللىقىنى تولۇق ئەكىس ئەتتۈرەلمەيدۇ.
تۇخۇمدان راكىنىڭ ئورتاق ئالاھىدىلىكى قورساق بوشلۇقىنىڭ كېڭىيىشى ۋە ئاسسىتنىڭ پەيدا بولۇشىدۇر. ئاسسىتتا ھۈجەيرە سۇيۇقلۇقىنىڭ توپلىنىشى كېسەللىكنىڭ ئىلگىرىلىشى ۋە ناچار ئاقىۋەت بىلەن مۇناسىۋەتلىك (15). دوكلاتلارغا قارىغاندا، بۇ ئۆزگىچە بۆلەك گىپوكسىيەلىك بولۇپ، قان تومۇر ئېندوتېلىي ئۆسۈش ئامىلى (VEGF) ۋە ئىندولېئامىن 2،3-دىئوكسىگېنازا (IDO) نىڭ سەۋىيىسى يۇقىرى بولۇپ، T تەڭشىگۈچ ھۈجەيرىلىرى ۋە مىئېلوئىد توسۇش ھۈجەيرىلىرى تەرىپىدىن سىڭىپ كىرىدۇ (15-18). ئاسسىتنىڭ ماددا ئالمىشىش مۇھىتى ئۆسمىنىڭ ئۆزىدىن پەرقلىق بولۇشى مۇمكىن، شۇڭا قورساق بوشلۇقىدىكى T ھۈجەيرىلىرىنىڭ قايتا پروگراممىلىنىشى ئېنىق ئەمەس. بۇنىڭدىن باشقا، ئۆسمە مۇھىتىدا مەۋجۇت بولغان ئاسسىت بىلەن مېتابولىتلار ئوتتۇرىسىدىكى ئاساسلىق پەرقلەر ۋە ھەر خىللىق ئىممۇنىتېت ھۈجەيرىلىرىنىڭ سىڭىپ كىرىشىگە ۋە ئۇلارنىڭ ئۆسمىلەرگە بولغان رولىنى توسۇشى مۇمكىن، شۇڭا تېخىمۇ كۆپ تەتقىقات ئېلىپ بېرىشقا ئېھتىياج بار.
بۇ مەسىلىلەرنى ھەل قىلىش ئۈچۈن، بىز ھەر خىل ھۈجەيرە تىپلىرىنى (CD4 + ۋە CD8 + T ھۈجەيرىلىرىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ)، شۇنداقلا ئۆسمىلەرنىڭ ئىچى ۋە ئارىلىقىنى تەتقىق قىلىش ئۈچۈن سەزگۈر ھۈجەيرە ئايرىش ۋە سۇيۇقلۇق خروماتوگرافىيەسى تەڭدەم ماسسا سپېكترومېتىرىيەسى (LC-MS/MS) ئۇسۇلىنى لايىھىلىدۇق. ئۇنىڭ مېتابولىتلىرى بىمارنىڭ ئوخشاش ئاسسىت ۋە ئۆسمە مۇھىتىدىكى ھۈجەيرىلەرنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ. بىز بۇ ئۇسۇلنى يۇقىرى ئۆلچەملىك ئېقىم سىتومېتىرىيەسى ۋە يەككە ھۈجەيرىلىك RNA تەرتىپلەش (scRNA-seq) بىلەن بىرلىكتە ئىشلىتىپ، بۇ ئاچقۇچلۇق توپلارنىڭ ماددا ئالمىشىش ھالىتىنىڭ يۇقىرى ئېنىقلىقتىكى سۈرىتىنى تەمىنلەيمىز. بۇ ئۇسۇل ئۆسمە T ھۈجەيرىلىرىدىكى 1-مېتىلنىكوتىنامىد (MNA) سەۋىيىسىنىڭ كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە ئاشقانلىقىنى بايقىدى، ھەمدە سىناق تەجرىبە نەتىجىسىدە MNA نىڭ T ھۈجەيرە ئىقتىدارىغا بولغان ئىممۇنىتېت تەڭشىگۈچ تەسىرى ئىلگىرى نامەلۇم ئىكەنلىكى كۆرسىتىلدى. ئادەتتە، بۇ ئۇسۇل ئۆسمىلەر بىلەن ئىممۇنىتېت ھۈجەيرىلىرى ئوتتۇرىسىدىكى ئۆز-ئارا ماددا ئالمىشىش ئۆز-ئارا تەسىرىنى ئاشكارىلايدۇ، ھەمدە ئىممۇنىتېت تەڭشىگۈچ مېتابولىتلىرى توغرىسىدا ئۆزگىچە چۈشەنچە بېرىدۇ، بۇ T ھۈجەيرىسىگە ئاساسلانغان تۇخۇمدان راكى ئىممۇنىتېت داۋالاش پۇرسەتلىرىنى داۋالاشتا پايدىلىق بولۇشى مۇمكىن.
بىز يۇقىرى ئۆلچەملىك ئېقىم سىتومېتىرىيەسىنى ئىشلىتىپ، گىليۇكوزا قوبۇل قىلىش مىقدارىنى بىرلا ۋاقىتتا مىقدارلاشتۇردۇق [2-(N-(7-نىتروفېنىل-2-ئوكسا-1,3-دىئازا-4-يىل)ئامىنو)-2-دېئوكسىگلۇكوزا (2-NBDG) ۋە مىتوخوندىرىيە پائالىيىتى [MitoTracker چوڭقۇر قىزىل (MT DR)] (7، 19، 20) ئىممۇنىتېت ھۈجەيرىلىرى ۋە ئۆسمە ھۈجەيرە توپلىرىنى پەرقلەندۈرىدىغان يانمۇ-يان تىپىك بەلگىلەر (S2-جەدۋەل ۋە S1A-رەسىم). بۇ تەھلىل T ھۈجەيرىلىرىگە سېلىشتۇرغاندا، ئاسسىت ۋە ئۆسمە ھۈجەيرىلىرىنىڭ گىليۇكوزا قوبۇل قىلىش سەۋىيەسى يۇقىرى، ئەمما مىتوخوندىرىيە پائالىيىتىدە پەرق كىچىك ئىكەنلىكىنى كۆرسەتتى. ئۆسمە ھۈجەيرىلىرىنىڭ [CD45-EpCAM (EpCAM)+] ئوتتۇرىچە گىليۇكوزا قوبۇل قىلىش مىقدارى T ھۈجەيرىلىرىنىڭكىدىن ئۈچ-تۆت ھەسسە، CD4 + T ھۈجەيرىلىرىنىڭ ئوتتۇرىچە گىليۇكوزا قوبۇل قىلىش مىقدارى CD8 + T ھۈجەيرىلىرىنىڭكىدىن 1.2 ھەسسە يۇقىرى، بۇ ئۆسمىگە سىڭىپ كىرىدىغان لىمفا ھۈجەيرىلىرىنىڭ (TIL) ئوخشاش TME دا بولسىمۇ ماددا ئالمىشىش تەلىپىنىڭ ئوخشىمايدىغانلىقىنى كۆرسىتىدۇ (1A-رەسىم). بۇنىڭغا سېلىشتۇرغاندا، ئۆسمە ھۈجەيرىلىرىدىكى مىتوخوندىرىيە پائالىيىتى CD4 + T ھۈجەيرىلىرى بىلەن ئوخشاش، ھەمدە ھەر ئىككى ھۈجەيرە تىپىدىكى مىتوخوندىرىيە پائالىيىتى CD8 + T ھۈجەيرىلىرىنىڭكىدىن يۇقىرى (1B-رەسىم). ئادەتتە، بۇ نەتىجىلەر ماددا ئالمىشىش سەۋىيەسىنى ئاشكارىلايدۇ. ئۆسمە ھۈجەيرىلىرىنىڭ ماددا ئالمىشىش پائالىيىتى CD4 + T ھۈجەيرىلىرىنىڭكىدىن يۇقىرى، CD4 + T ھۈجەيرىلىرىنىڭ ماددا ئالمىشىش پائالىيىتى CD8 + T ھۈجەيرىلىرىنىڭكىدىن يۇقىرى. ھۈجەيرە تىپىدىكى بۇ تەسىرلەرگە قارىماي، CD4 + ۋە CD8 + T ھۈجەيرىلىرىنىڭ ماددا ئالمىشىش ھالىتى ياكى ئۇلارنىڭ ئاسسىتتىكى نىسبىتىدە ئۆسمىلەرگە سېلىشتۇرغاندا مۇقىم پەرق يوق (1C-رەسىم). بۇنىڭغا سېلىشتۇرغاندا، CD45 ھۈجەيرە قىسمىدا، ئۆسمىدىكى EpCAM+ ھۈجەيرىلىرىنىڭ نىسبىتى ئاسسىتقا سېلىشتۇرغاندا ئاشقان (1D-رەسىم). بىز يەنە EpCAM+ ۋە EpCAM- ھۈجەيرە تەركىبلىرى ئوتتۇرىسىدا روشەن ماددا ئالمىشىش پەرقىنى كۆزەتتۇق. EpCAM+ (ئۆسمە) ھۈجەيرىلىرىنىڭ گلۇكوزا سۈمۈرۈش ۋە مىتوخوندىرىيە پائالىيىتى EpCAM- ھۈجەيرىلىرىگە قارىغاندا يۇقىرى بولۇپ، بۇ TME دىكى ئۆسمە ھۈجەيرىلىرىدىكى فىبروبلاستلارنىڭ ماددا ئالمىشىش پائالىيىتىدىن خېلىلا يۇقىرى (1-رەسىم، E ۋە F).
(A ۋە B) CD4 + T ھۈجەيرىلىرىنىڭ گىليۇكوزا قوبۇل قىلىش نىسبىتى (2-NBDG) (A) ۋە مىتوخوندىرىيە پائالىيىتى (MitoTracker قېنىق قىزىل) (B) ۋەكىللىك گىرافىكلىرى (سول تەرەپتە) ۋە جەدۋەللىك سانلىق مەلۇماتلار (ئوڭ تەرەپتە)، ئاسسىت ۋە ئۆسمىدىن كەلگەن CD8 + T ھۈجەيرىلىرى ۋە EpCAM + CD45-ئۆسۈم ھۈجەيرىلىرى. (C) ئاسسىت ۋە ئۆسمىدىكى CD4 + ۋە CD8 + ھۈجەيرىلىرىنىڭ (CD3 + T ھۈجەيرىلىرىنىڭ) نىسبىتى. (D) ئاسسىت ۋە ئۆسمىدىكى (CD45−) EpCAM + ئۆسمە ھۈجەيرىلىرىنىڭ نىسبىتى. (E ۋە F) EpCAM + CD45-ئۆسۈم ۋە EpCAM-CD45-ماترىتسىلىق گىليۇكوزا قوبۇل قىلىش نىسبىتى (2-NBDG) (E) ۋە مىتوخوندىرىيە پائالىيىتى (MitoTracker قېنىق قىزىل) (F) ۋەكىللىك گىرافىكلىرى (سول تەرەپتە) ۋە جەدۋەللىك سانلىق مەلۇماتلار (ئوڭ تەرەپتە) ئاسسىت ۋە ئۆسمە ھۈجەيرىلىرى. (G) ئېقىم سىتومېتىرىيەسى ئارقىلىق CD25، CD137 ۋە PD1 ئىپادىلىنىشىنىڭ ۋەكىللىك گىرافىكلىرى. (H ۋە I) CD4 + T ھۈجەيرىلىرى (H) ۋە CD8 + T ھۈجەيرىلىرى (I) دىكى CD25، CD137 ۋە PD1 ئىپادىسى. (J ۋە K) CCR7 ۋە CD45RO نىڭ ئىپادىسىگە ئاساسەن، ساددا، مەركىزىي خاتىرە (Tcm)، ئۈنۈمچى (Teff) ۋە ئۈنۈمچى خاتىرە (Tem) فېنوتىپلىرى. ئاسسىت ۋە ئۆسمىلەردىكى CD4 + T ھۈجەيرىلىرى (J) ۋە CD8 + T ھۈجەيرىلىرىنىڭ (K) ۋەكىللىك رەسىملىرى (سولدا) ۋە جەدۋەل سانلىق مەلۇماتلىرى (ئوڭدا). P قىممىتى جۈپلەشكەن t سىنىقى ئارقىلىق بېكىتىلىدۇ (*P<0.05, **P<0.01 ۋە ***P<0.001). سىزىق ماس كېلىدىغان بىمارلارنى كۆرسىتىدۇ (n = 6). FMO، فلۇئورېسسېنسىيە بىرنى چىقىرىۋېتىدۇ؛ MFI، ئوتتۇرىچە فلۇئورېسسېنسىيە كۈچلۈكلۈكى.
تېخىمۇ چوڭقۇر تەھلىل قىلىش ئارقىلىق يۇقىرى دەرىجىدە ئېنىقلانغان T ھۈجەيرىسىنىڭ فېنوتىپ ھالىتى ئوتتۇرىسىدىكى باشقا مۇھىم پەرقلەر بايقالدى. ئۆسمىلەردە ئاكتىپلانغان (1-رەسىم، G دىن I گىچە) ۋە ئۈنۈمچى خاتىرە (1-رەسىم، J ۋە K) ئاسسىتقا (CD3 + T ھۈجەيرىلىرىنىڭ نىسبىتى) قارىغاندا كۆپ ئۇچرايدۇ. شۇنىڭغا ئوخشاش، ئاكتىپلىنىش بەلگىلىرى (CD25 ۋە CD137) ۋە ئازىيىش بەلگىلىرى [پروگراممىلانغان ھۈجەيرە ئۆلۈم ئاقسىلى 1 (PD1)] ئارقىلىق فېنوتىپنى تەھلىل قىلىش ئارقىلىق، بۇ توپلارنىڭ ماددا ئالمىشىش ئالاھىدىلىكلىرى ئوخشىمىسىمۇ (S1-رەسىم، B دىن E گىچە)، ئەمما نائىد، ئۈنۈمچى ياكى خاتىرە تارماق گۇرۇپپىلىرى ئارىسىدا ھېچقانداق مۇھىم ماددا ئالمىشىش پەرقى كۆزىتىلمىگەنلىكى كۆرسىتىلدى (S1-رەسىم، F دىن I گىچە). بۇ نەتىجىلەر ماشىنا ئۆگىنىش ئۇسۇلى ئارقىلىق ھۈجەيرە فېنوتىپلىرىنى ئاپتوماتىك بېكىتىش ئارقىلىق جەزملەشتۈرۈلدى (21)، بۇ يەنە بىمارنىڭ ئاسسىتىدا كۆپ ساندىكى سۆڭەك يىلىكى ھۈجەيرىلىرىنىڭ (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) بارلىقىنى ئاشكارىلىدى (S2A-رەسىم). بارلىق ئېنىقلانغان ھۈجەيرە تىپلىرى ئىچىدە، بۇ مىئېلوئىد ھۈجەيرە توپى ئەڭ يۇقىرى گلۇكوزا سۈمۈرۈش ۋە مىتوخوندىرىيە پائالىيىتىنى كۆرسەتتى (S2-رەسىم، B دىن G گىچە). بۇ نەتىجىلەر HGSC بىمارلىرىدىكى ئاسسىت ۋە ئۆسمىلەردە بايقالغان كۆپ خىل ھۈجەيرە تىپلىرى ئوتتۇرىسىدىكى كۈچلۈك ماددا ئالمىشىش پەرقىنى گەۋدىلەندۈرىدۇ.
TIL نىڭ مېتابونومىيىلىك ئالاھىدىلىكلىرىنى چۈشىنىشتىكى ئاساسلىق قىيىنچىلىق، ئۆسمىلەردىن يېتەرلىك ساپلىق، سۈپەت ۋە مىقداردىكى T ھۈجەيرە ئەۋرىشكىلىرىنى ئايرىۋېلىش ئېھتىياجى. يېقىنقى تەتقىقاتلار شۇنى كۆرسەتتىكى، ئېقىم سىتومېتىرىيەسىگە ئاساسلانغان تۈرگە ئايرىش ۋە مارجاننى بايىتىش ئۇسۇللىرى ھۈجەيرە مېتابولىت پروفىلىدا ئۆزگىرىشلەرنى كەلتۈرۈپ چىقىرىشى مۇمكىن (22-24). بۇ مەسىلىنى ھەل قىلىش ئۈچۈن، بىز LC-MS/MS ئارقىلىق تەھلىل قىلىشتىن بۇرۇن، ئوپېراتسىيە ئارقىلىق كېسىۋېتىلگەن ئىنسان تۇخۇمدان راكىدىن TIL نى ئايرىش ۋە ئايرىش ئۈچۈن مارجاننى بايىتىش ئۇسۇلىنى ئەلالاشتۇردۇق (ماتېرىياللار ۋە ئۇسۇللارغا قاراڭ؛ 2A-رەسىم). بۇ كېلىشىمنىڭ مېتابولىت ئۆزگىرىشىگە بولغان ئومۇمىي تەسىرىنى باھالاش ئۈچۈن، بىز يۇقىرىدىكى مارجاننى ئايرىش باسقۇچىدىن كېيىن ساغلام ئىئانە قىلغۇچىلار تەرىپىدىن ئاكتىپلاشتۇرۇلغان T ھۈجەيرىلىرىنىڭ مېتابولىت پروفىلى بىلەن مارجان ئايرىلمىغان، ئەمما مۇز ئۈستىدە قالغان ھۈجەيرىلەرنى سېلىشتۇردۇق. بۇ سۈپەت كونترول ئانالىزى بۇ ئىككى ئەھۋال ئوتتۇرىسىدا يۇقىرى مۇناسىۋەت بارلىقىنى (r = 0.77)، ھەمدە 86 مېتابولىت گۇرۇپپىسىنىڭ تېخنىكىلىق تەكرارلىنىشچانلىقى يۇقىرى تەكرارلىنىشچانلىقىغا ئىگە ئىكەنلىكىنى بايقىدى (2B-رەسىم). شۇڭلاشقا، بۇ ئۇسۇللار ھۈجەيرە تىپىنى بېيىتىش جەريانىدىكى ھۈجەيرىلەردە توغرا مېتابولىت ئانالىزىنى ئېلىپ بارالايدۇ، بۇ ئارقىلىق HGSC دىكى ئالاھىدە مېتابولىتلارنى ئېنىقلاش ئۈچۈن تۇنجى يۇقىرى ئېنىقلىقتىكى سۇپا بىلەن تەمىنلىيەلەيدۇ، شۇ ئارقىلىق كىشىلەرنىڭ ھۈجەيرە ئالاھىدىلىكىنى چوڭقۇر چۈشىنىشىگە شارائىت ھازىرلايدۇ. جىنسىي مېتابولىت پروگراممىسى.
(A) ماگنىتلىق مارجاننى بايىتىشنىڭ سىخېماتىك دىئاگراممىسى. LC-MS/MS ئارقىلىق ئانالىز قىلىشتىن بۇرۇن، ھۈجەيرىلەر ئارقا-ئارقىدىن ئۈچ قېتىم ماگنىتلىق مارجاننى بايىتىشتىن ئۆتىدۇ ياكى مۇز ئۈستىدە قالىدۇ. (B) بايىتىش تىپىنىڭ مېتابولىتلارنىڭ موللۇقىغا تەسىرى. ھەر بىر بايىتىش تىپى ئۈچۈن ئۈچ ئۆلچەشنىڭ ئوتتۇرىچە قىممىتى ± SE. كۈلرەڭ سىزىق 1:1 مۇناسىۋىتىنى ئىپادىلەيدۇ. ئوق بەلگىسىدە كۆرسىتىلگەن تەكرار ئۆلچەشلەرنىڭ سىنىپ ئىچىدىكى مۇناسىۋەت (ICC). NAD، نىكوتىنامىد ئادېنىن دىنۇكلېئوتىد. (C) بىمارنىڭ مېتابولىت ئانالىزىنىڭ خىزمەت ئېقىمىنىڭ سىخېماتىك دىئاگراممىسى. ئاسسىت ياكى ئۆسمىلەر بىمارلاردىن يىغىۋېلىنىدۇ ۋە توڭلىتىپ ساقلىنىدۇ. ھەر بىر ئەۋرىشكىنىڭ ئاز بىر قىسمى ئېقىم سىتومېتىرىيەسى ئارقىلىق ئانالىز قىلىندى، قالغان ئەۋرىشكىلەر CD4+، CD8+ ۋە CD45- ھۈجەيرىلىرى ئۈچۈن ئۈچ قېتىم بايىتىشتىن ئۆتتى. بۇ ھۈجەيرە پارچىلىرى LC-MS/MS ئارقىلىق ئانالىز قىلىندى. (D) ئۆلچەملەشكەن مېتابولىت موللۇقىنىڭ ئىسسىقلىق خەرىتىسى. دېندروگرامما ئەۋرىشكىلەر ئارىسىدىكى ئېۋكلىد ئارىلىقىنىڭ ۋارد توپلىنىشىنى ئىپادىلەيدۇ. (E) ئۈلگە مېتابولىت خەرىتىسىنىڭ ئاساسلىق تەركىب ئانالىزى (PCA)، ھەر بىر ئۈلگىنىڭ ئۈچ قېتىم تەكرارلىنىشىنى كۆرسىتىدۇ، ئوخشاش بىر بىمارنىڭ ئۈلگىلىرى سىزىق ئارقىلىق تۇتاشتۇرۇلىدۇ. (F) بىمارغا باغلىق بولغان ئۈلگىنىڭ مېتابولىت پروفىلىنىڭ PCA (يەنى قىسمەن ئارتۇقچە ئىشلىتىش)؛ ئۈلگە تىپى قاپاق شەكىللىك قېپى بىلەن چەكلىنىدۇ. PC1، ئاساسلىق تەركىب 1؛ PC2، ئاساسلىق تەركىب 2.
ئاندىن، بىز بۇ بايىتىش ئۇسۇلىنى قوللانغان بولۇپ، ئالتە HGSC بىمارىنىڭ دەسلەپكى ئاسسىت ۋە ئۆسمىلىرىدىكى CD4 +، CD8 + ۋە CD45-ھۈجەيرە بۆلەكلىرىدىكى 99 خىل مېتابولىتنى تەھلىل قىلدۇق (2C-رەسىم، S3A-رەسىم ۋە S3 ۋە S4-جەدۋەل). قىزىقىدىغان نوپۇس ئەسلىدىكى چوڭ تىپتىكى تىرىك ھۈجەيرە ئەۋرىشكىسىنىڭ %2 تىن %70 گىچە بولغان قىسمىنى ئىگىلەيدۇ، ھەمدە ھۈجەيرىلەرنىڭ نىسبىتى بىمارلار ئارىسىدا زور دەرىجىدە پەرقلىنىدۇ. مارجانلارنى ئايرىۋەتكەندىن كېيىن، قىزىقىدىغان موللاشتۇرۇلغان بۆلەك (CD4 +، CD8 + ياكى CD45-) ئەۋرىشكىدىكى بارلىق تىرىك ھۈجەيرىلەرنىڭ ئوتتۇرىچە %85 تىن كۆپرەكىنى ئىگىلەيدۇ. بۇ بايىتىش ئۇسۇلى بىزگە ئىنسان ئۆسمىسى توقۇلمىسىنىڭ ماددا ئالمىشىشىدىن ھۈجەيرە توپلىرىنى تەھلىل قىلىشقا يول قويىدۇ، بۇنى چوڭ ئەۋرىشكىلەردىن قىلىش مۇمكىن ئەمەس. بۇ كېلىشىم ئارقىلىق، بىز l-kinurenine ۋە adenosine، يەنى بۇ ئىككى خىل ياخشى خاراكتېرگە ئىگە ئىممۇنىتېت بېسىمى مېتابولىتلىرىنىڭ ئۆسمە T ھۈجەيرىلىرى ياكى ئۆسمە ھۈجەيرىلىرىدە يۇقىرى ئىكەنلىكىنى ئېنىقلىدۇق (S3، B ۋە C-رەسىم). شۇڭا، بۇ نەتىجىلەر بىزنىڭ ھۈجەيرە ئايرىش ۋە ماسسا سپېكترومېتىرىيەسى تېخنىكىمىزنىڭ بىمار توقۇلمىلىرىدىكى بىئولوگىيىلىك مۇھىم مېتابولىتلارنى تېپىشتىكى ئىشەنچلىكلىكى ۋە ئىقتىدارىنى نامايان قىلىدۇ.
بىزنىڭ ئانالىزىمىزدا يەنە بىمارلارنىڭ ئىچى ۋە ئارىسىدىكى ھۈجەيرە تىپلىرىنىڭ كۈچلۈك ماددا ئالمىشىش ئايرىمىسى بايقالغان (2D-رەسىم ۋە S4A-رەسىم). بولۇپمۇ، باشقا بىمارلارغا سېلىشتۇرغاندا، 70-بىمارنىڭ ماددا ئالمىشىش ئالاھىدىلىكلىرى ئوخشىمايدۇ (2E-رەسىم ۋە S4B-رەسىم)، بۇ بىمارلار ئارىسىدا ماددا ئالمىشىش جەھەتتە زور دەرىجىدە كۆپ خىللىق بولۇشى مۇمكىنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. باشقا بىمارلارغا سېلىشتۇرغاندا (1.2 دىن 2 لىتىرغىچە؛ S1-جەدۋەل)، 70-بىماردا توپلانغان ئاسسىتنىڭ ئومۇمىي مىقدارى (80 مىللىلىتىر) ئازراق ئىكەنلىكىنى ئالاھىدە تىلغا ئېلىشقا ئەرزىيدۇ. ئاساسلىق تەركىب ئانالىزى جەريانىدا (مەسىلەن، قىسمەن ئارتۇقچىلىق ئانالىزى ئارقىلىق) بىمارلار ئارا كۆپ خىللىقنىڭ كونترول قىلىنىشى ھۈجەيرە تىپلىرى ئارىسىدا مۇقىم ئۆزگىرىشلەرنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ، ھەمدە ھۈجەيرە تىپلىرى ۋە/ياكى مىكرو مۇھىت مېتابولىت پروفىلىغا ئاساسەن ئېنىق توپلانغان (2F-رەسىم). يەككە مېتابولىتلارنى ئانالىز قىلىش بۇ تەسىرلەرنى تەكىتلەپ، ھۈجەيرە تىپلىرى بىلەن مىكرو مۇھىت ئوتتۇرىسىدىكى مۇھىم پەرقلەرنى ئاشكارىلىدى. ئەڭ ئېغىر پەرقنىڭ MNA ئىكەنلىكىنى ئالاھىدە تىلغا ئېلىشقا ئەرزىيدۇ، ئۇ ئادەتتە CD45-ھۈجەيرىلىرى ۋە ئۆسمىگە سىڭىپ كىرىدىغان CD4+ ۋە CD8+ ھۈجەيرىلىرىدە مول بولىدۇ (3A-رەسىم). CD4 + ھۈجەيرىلىرى ئۈچۈن، بۇ تەسىر ئەڭ روشەن بولۇپ، CD8 + ھۈجەيرىلىرىدىكى MNA مۇ مۇھىتنىڭ كۈچلۈك تەسىرىگە ئۇچرىغاندەك قىلىدۇ. قانداقلا بولمىسۇن، بۇ مۇھىم ئەمەس، چۈنكى ئالتە بىمارنىڭ پەقەت ئۈچىلا ئۆسمە CD8 + نومۇرىنى باھالىيالايدۇ. MNA دىن باشقا، ئاسسىت ۋە ئۆسمىلەردىكى ھەر خىل ھۈجەيرىلەردە، TIL دا ناچار خاراكتېرلىنىدىغان باشقا مېتابولىتلارمۇ پەرقلىق مول (S3 ۋە S4-رەسىملەر). شۇڭا، بۇ سانلىق مەلۇماتلار كېيىنكى تەتقىقات ئۈچۈن ئۈمىدۋار ئىممۇنىتېت تەڭشىگۈچ مېتابولىتلار توپلىمىنى ئاشكارىلىدى.
(A) ئاسسىت ۋە ئۆسمىدىن كېلىپ چىققان CD4+، CD8+ ۋە CD45- ھۈجەيرىلىرىدىكى MNA نىڭ نورماللاشتۇرۇلغان مىقدارى. قۇتىدا ئوتتۇرا (سىزىق)، كۋادراتلار ئارا دائىرىسى (رامكا شارچىسى) ۋە سانلىق مەلۇمات دائىرىسى كۆرسىتىلدى، بۇلار كۋادراتلار ئارا دائىرىسىنىڭ (رامكا مۈڭگۈزى) 1.5 ھەسسىسىگىچە. «بىمار ماتېرىياللىرى ۋە ئۇسۇللىرى» دا بايان قىلىنغاندەك، بىمارنىڭ لىمما قىممىتىدىن پايدىلىنىپ P قىممىتىنى بەلگىلەڭ (*P<0.05 ۋە **P<0.01). (B) MNA ماددا ئالمىشىشىنىڭ سىخېما دىئاگراممىسى (60). مېتابولىتلار: S-ئادېنوسىل-1-مېتىئونىن؛ SAH، S-ئادېنوسئىن-1-ھوموسىستېئىن؛ NA، نىكوتىنامىدى؛ MNA، 1-مېتىلنىكوتىنامىدى؛ 2-PY، 1-مېتىل-2-پىرىدون-5-كاربوكسامىد؛ 4-PY، 1-مېتىل-4-پىرىدون-5-كاربوكسامىد؛ NR، نىكوتىنامىدى رىبوزا؛ NMN، نىكوتىنامىدى مونونۇكلېئوتىد. ئېنزىملار (يېشىل): NNMT، نىكوتىنامىت N-مېتىل ترانسفېرازا؛ SIRT، سىرتۇئىنلار؛ NAMPT، نىكوتىنامىت فوسفورىبوسىل ترانسفېرازا؛ AOX1، ئالدېھىد ئوكسىدازا 1؛ NRK، نىكوتىنامىت رىبوسىد كىنازا؛ NMNAT، نىكوتىنامىت مونو نۇكلېئوتىد ئادېنىلات ترانسفېرازا؛ Pnp1، پۇرىن نۇكلېئوزىد فوسفورىلازا. (C) ئاسسىت (كۈلرەڭ) ۋە ئۆسمىنىڭ scRNA-seq نىڭ t-SNE (قىزىل؛ n = 3 بىمار). (D) scRNA-seq ئارقىلىق ئېنىقلانغان ھەر خىل ھۈجەيرە توپلىرىدىكى NNMT ئىپادىسى. (E) SK-OV-3، ئىنسان ئېمبىرىئون بۆرىكىدىكى (HEK) 293T، T ھۈجەيرىلىرى ۋە MNA بىلەن داۋالانغان T ھۈجەيرىلىرىدىكى NNMT ۋە AOX1 نىڭ ئىپادىسى. قاتلانغان ئىپادىلەش SK-OV-3 گە نىسبەتەن كۆرسىتىلدى. SEM بىلەن ئىپادىلەش ئەندىزىسى كۆرسىتىلدى (n = 6 ساغلام ئىئانە قىلغۇچى). Ct قىممىتى 35 تىن يۇقىرى بولسا بايقالمايدۇ (UD). (F) SK-OV-3، HEK293T، T ھۈجەيرىلىرى ۋە 8mM MNA بىلەن داۋالانغان T ھۈجەيرىلىرىدىكى SLC22A1 ۋە SLC22A2 نىڭ ئىپادىلىنىشى. قاتلانغان ئىپادىلەش SK-OV-3 گە نىسبەتەن كۆرسىتىلدى. SEM بىلەن ئىپادىلەش شەكلى كۆرسىتىلدى (n = 6 ساغلام ئىئانە قىلغۇچى). Ct قىممىتى 35 تىن يۇقىرى بولسا بايقالمايدۇ (UD). (G) MNA بىلەن 72 سائەت ئىنكۇباتسىيە قىلىنغاندىن كېيىن ئاكتىپلانغان ساغلام ئىئانە قىلغۇچى T ھۈجەيرىلىرىدىكى ھۈجەيرە MNA مىقدارى. SEM بىلەن ئىپادىلەش شەكلى كۆرسىتىلدى (n = 4 ساغلام ئىئانە قىلغۇچى).
MNA نىكوتىنامىد N-مېتىل ترانسفېرازا (NNMT؛ 3B-رەسىم) ئارقىلىق S-ئادېنوسىل-1-مېتىئونىن (SAM) دىن مېتىل گۇرۇپپىسىنى نىكوتىنامىدقا (NA) يۆتكەش ئارقىلىق ھاسىل بولىدۇ. NNMT ھەر خىل ئىنسان راك كېسەللىكلىرىدە ئارتۇق ئىپادىلىنىدۇ ۋە كۆپىيىش، تاجاۋۇز قىلىش ۋە مېتاستاز بىلەن مۇناسىۋەتلىك (25-27). TME دىكى T ھۈجەيرىلىرىدىكى MNA نىڭ مەنبەسىنى تېخىمۇ ياخشى چۈشىنىش ئۈچۈن، بىز ئۈچ HGSC بىمارىنىڭ ئاسسىت ۋە ئۆسمىلىرىدىكى NNMT نىڭ ھۈجەيرە تىپلىرى بويىچە ئىپادىلىنىشىنى خاراكتېرلەندۈرۈش ئۈچۈن scRNA-seq نى ئىشلەتتۇق (S5-جەدۋەل). تەخمىنەن 6500 ھۈجەيرىنى تەھلىل قىلىش شۇنى كۆرسەتتىكى، ئاسسىت ۋە ئۆسمە مۇھىتىدا، NNMT ئىپادىسى پەرەز قىلىنغان فىبروبلاست ۋە ئۆسمە ھۈجەيرە توپلىرى بىلەنلا چەكلىنىدۇ (3-رەسىم، C ۋە D). شۇنى ئەسكەرتىش كېرەككى، PTPRC (CD45 +) نى ئىپادىلەيدىغان ھېچقانداق توپتا روشەن NNMT ئىپادىسى يوق (3D-رەسىم ۋە S5A-رەسىم)، بۇ مېتابولىت سپېكتىرىدا بايقالغان MNA نىڭ T ھۈجەيرىلىرىگە كىرگۈزۈلگەنلىكىنى كۆرسىتىدۇ. ئالدېھىد ئوكسىدازا 1 (AOX1) نىڭ ئىپادىلىنىشى MNA نى 1-مېتىل-2-پىرىدون-5-كاربوكسامىد (2-PYR) ياكى 1-مېتىل-4-پىرىدون-5-كاربوكسامىد (4-PYR) غا ئايلاندۇرىدۇ؛ 3B-رەسىم) يەنە COL1A1 نى ئىپادىلەيدىغان فىبروبلاستلار توپى بىلەنلا چەكلىنىدۇ (S5A-رەسىم)، بۇلار بىرلىكتە T ھۈجەيرىلىرىنىڭ ئادەتتىكى MNA مېتابولىزم ئىقتىدارىنىڭ يوقلۇقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. بۇ MNA بىلەن مۇناسىۋەتلىك گېنلارنىڭ ئىپادىلىنىش ئەندىزىسى HGSC بىمارلىرىنىڭ ئاسسىتلىرىدىن ئېلىنغان ئىككىنچى مۇستەقىل ھۈجەيرە سانلىق مەلۇماتلىرى توپلىمى ئارقىلىق دەلىللەندى (S5B-رەسىم؛ n = 6) (16). بۇنىڭدىن باشقا، MNA بىلەن داۋالانغان ساغلام ئىئانە قىلغۇچى T ھۈجەيرىلىرىنىڭ مىقدارلىق پولىمېراز زەنجىرسىمان رېئاكسىيەسى (qPCR) ئانالىزى SK-OV-3 تۇخۇمدان ئۆسمىسى ھۈجەيرىلىرى بىلەن سېلىشتۇرغاندا، NNMT ياكى AOX1 نىڭ دېگۈدەك ئىپادىلەنمىگەنلىكىنى كۆرسەتتى (3E-رەسىم). بۇ كۈتۈلمىگەن نەتىجىلەر MNA نىڭ فىبروبلاستلار ياكى ئۆسمىلەردىن TME دىكى قوشنا T ھۈجەيرىلىرىگە ئاجرىلىپ چىقىشى مۇمكىنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
گەرچە نامزاتلار ئېرىيدىغان توشۇغۇچى 22 (SLC22) ئائىلىسى (SLC22A1, SLC22A2 ۋە SLC22A3) تەرىپىدىن كودلانغان 1 دىن 3 گىچە بولغان ئورگانىك كاتىيون توشۇغۇچى ئائىلىسىنى (OCT1, OCT2 ۋە OCT3) ئۆز ئىچىگە ئالسىمۇ، MNA نىڭ يوشۇرۇن توشۇغۇچىلىرى يەنىلا ئېنىقلانمىغان (28). ساغلام ئىئانە قىلغۇچى T ھۈجەيرىلىرىدىن ئېلىنغان mRNA نىڭ QPCR دا SLC22A1 نىڭ ئىپادىلىنىش سەۋىيىسى تۆۋەن، ئەمما SLC22A2 نىڭ بايقىغىلى بولمايدىغان سەۋىيىسى كۆرسىتىلگەن، بۇ ئۇنىڭ ئىلگىرى ئەدەبىياتتا خەۋەر قىلىنغانلىقىنى جەزملەشتۈرگەن (3F-رەسىم) (29). ئەكسىچە، SK-OV-3 تۇخۇمدان ئۆسمىسى ھۈجەيرە لىنىيىسى ھەر ئىككى توشۇغۇچىنىڭ سەۋىيىسىنى يۇقىرى ئىپادىلىگەن (3F-رەسىم).
T ھۈجەيرىلىرىنىڭ يات MNA نى سۈمۈرۈش ئىقتىدارىغا ئىگە بولۇش ئېھتىماللىقىنى سىناق قىلىش ئۈچۈن، ساغلام ئىئانە قىلغۇچى T ھۈجەيرىلىرى MNA نىڭ ھەر خىل قويۇقلۇقى ئاستىدا 72 سائەت يېتىشتۈرۈلدى. سىرتقى MNA بولمىغاندا، ھۈجەيرە ئىچىدىكى MNA نى بايقىغىلى بولمايدۇ (3G-رەسىم). قانداقلا بولمىسۇن، سىرتقى MNA بىلەن داۋالانغان ئاكتىپلاشتۇرۇلغان T ھۈجەيرىلىرى ھۈجەيرىلەردىكى MNA نىڭ مىقدارىنىڭ دورا مىقدارىغا باغلىق ئېشىپ، 6 mM MNA غىچە يەتكەن (3G-رەسىم). بۇ نەتىجە، توشۇغۇچىنىڭ ئىپادىلىنىش سەۋىيەسىنىڭ تۆۋەن بولۇشى ۋە ھۈجەيرە ئىچىدىكى MNA مېتابولىزمىغا مەسئۇل ئاساسلىق ئېنزىمنىڭ كەمچىل بولۇشىغا قارىماي، TIL نىڭ يەنىلا MNA نى سۈمۈرۈۋالالايدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
بىمارلارنىڭ T ھۈجەيرىلىرىدىكى مېتابولىتلارنىڭ دائىرىسى ۋە سىناق نەيچىسىدىكى MNA سۈمۈرۈش تەجرىبىلىرى راك كېسىلىگە مۇناسىۋەتلىك فىبروبلاستلارنىڭ (CAF) MNA ئاجرىتىپ چىقىرىشى ۋە ئۆسمە ھۈجەيرىلىرىنىڭ TIL نىڭ فېنوتىپى ۋە ئىقتىدارىنى تەڭشىشى مۇمكىنلىكىنى ئاشۇرىدۇ. MNA نىڭ T ھۈجەيرىلىرىگە بولغان تەسىرىنى ئېنىقلاش ئۈچۈن، ساغلام ئىئانە قىلغۇچى T ھۈجەيرىلىرى سىناق نەيچىسىدە MNA بار ياكى يوق ھالەتتە ئاكتىپلاشتۇرۇلدى، ھەمدە ئۇلارنىڭ كۆپىيىشى ۋە سىتوكىن ئىشلەپچىقىرىشى باھالاندى. ئەڭ يۇقىرى مىقداردا MNA قوشۇلغاندىن كېيىن 7 كۈن ئۆتكەندىن كېيىن، نوپۇسنىڭ ئىككى ھەسسە كۆپىيىش سانى ئوتتۇراھال دەرىجىدە ئازايدى، شۇنىڭ بىلەن بىر ۋاقىتتا بارلىق مىقدارلاردا كۈچلۈكلۈك ساقلاندى (4A-رەسىم). بۇنىڭدىن باشقا، سىرتقى MNA نى داۋالاش ئۆسمە نېكروز ئامىلى-α نى ئىپادىلەيدىغان CD4+ ۋە CD8+ T ھۈجەيرىلىرىنىڭ نىسبىتىنى ئاشۇردى (TNFα؛ 4B-رەسىم). ئەكسىچە، IFN-γ نىڭ ھۈجەيرە ئىچىدىكى ئىشلەپچىقىرىلىشى CD4+ T ھۈجەيرىلىرىدە كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە ئازايدى، ئەمما CD8+ T ھۈجەيرىلىرىدە ئۇنداق ئەمەس، ھەمدە ئىنتېرلېيكىن 2 دا (IL-2؛ 4-رەسىم، C ۋە D) كۆرۈنەرلىك ئۆزگىرىش بولمىدى. شۇڭلاشقا، بۇ MNA بىلەن داۋالانغان T ھۈجەيرە مەدەنىيىتىدىن ئېلىنغان ئۈستۈنكى قەۋەتلەرنىڭ ئېنزىمغا باغلىنىشلىق ئىممۇنوسوربېنت سىنىقى (ELISA) TNFα نىڭ كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە ئېشىشى، IFN-γ نىڭ تۆۋەنلىشى ۋە IL-2 نىڭ ئۆزگىرىشى يوقلىقىنى كۆرسەتتى (4-رەسىم، E دىن G غىچە). . IFN-γ نىڭ تۆۋەنلىشى MNA نىڭ T ھۈجەيرىلىرىنىڭ ئۆسمىگە قارشى تۇرۇش پائالىيىتىنى چەكلەشتە رول ئوينايدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. MNA نىڭ T ھۈجەيرىسى ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلىدىغان سىتوتوزغا بولغان تەسىرىنى تەقلىد قىلىش ئۈچۈن، ساغلام ئىئانە قىلغۇچىنىڭ پېرىفېرىيە قان مونونۇكلېئارلىق ھۈجەيرىلىرى (PBMC) تەرىپىدىن فولات رېتسېپتورى α ۋە يېشىل فلۇئورېسسېنت ئاقسىلى (GFP) -CAR-T) ھۈجەيرىلىرى تەرىپىدىن تەڭشىلىنىدىغان CAR-T (GFP) نى نىشان قىلغان خىمېر ئانتىگېن رېتسېپتورى T (FRα-CAR-T) ھۈجەيرىلىرى ئىشلەپچىقىرىلىدۇ. CAR-T ھۈجەيرىلىرى MNA نىڭ ئالدىدا 24 سائەت يېتىشتۈرۈلدى، ئاندىن 10:1 ئېففېكتور بىلەن نىشان نىسبىتىدە فولات رېتسېپتورى α نى ئىپادىلەيدىغان ئىنسان SK-OV-3 تۇخۇمدان ئۆسمىسى ھۈجەيرىلىرى بىلەن بىرلىكتە يېتىشتۈرۈلدى. MNA بىلەن داۋالاش FRα-CAR-T ھۈجەيرىلىرىنىڭ ئۆلتۈرۈش پائالىيىتىنى كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە تۆۋەنلىتىپ، ئادېنوزىن بىلەن داۋالاش FRα-CAR-T ھۈجەيرىلىرىگە ئوخشايدۇ (4H-رەسىم).
(A) 7-كۈنى بىۋاسىتە مەدەنىيەتتىن ئېلىنغان ئومۇمىي جانلىق ھۈجەيرە سانى ۋە نوپۇسنىڭ قوشلىنىشى (PD). سىزىقلىق دىئاگرامما ئالتە ساغلام ئىئانە قىلغۇچىنىڭ ئوتتۇرىچە قىممىتى + SEM نى كۆرسىتىدۇ. كەم دېگەندە n = 3 مۇستەقىل سىناقتىن ئېلىنغان سانلىق مەلۇماتلارنى كۆرسىتىدۇ. (B دىن D غىچە) CD3/CD28 ۋە IL-2 T ھۈجەيرىلىرىنى ئۆزلىرىنىڭ MNA قويۇقلۇقىدا 7 كۈن ئاكتىپلاشتۇرۇش ئۈچۈن ئىشلىتىلدى. ئانالىز قىلىشتىن بۇرۇن، ھۈجەيرىلەر GolgiStop بىلەن PMA/ئىئونومىسىن بىلەن 4 سائەت قوزغىتىلدى. T ھۈجەيرىلىرىدىكى TNFα (B) ئىپادىسى. تىرىك ھۈجەيرىلەردىكى TNFα ئىپادىسىنىڭ مىسال رەسىمى (سولدا) ۋە جەدۋەل سانلىق مەلۇماتلىرى (ئوڭدا). T ھۈجەيرىلىرىدىكى IFN-γ (C) ۋە IL-2 (D) ئىپادىسى. سىتوكىنلارنىڭ ئىپادىسى ئېقىم سىتومېتىرىيەسى ئارقىلىق ئۆلچەندى. سىزىقلىق دىئاگرامما ئوتتۇرىچە قىممىتى (n = 6 ساغلام ئىئانە قىلغۇچى) + SEM نى كۆرسىتىدۇ. P قىممىتىنى بېكىتىش ئۈچۈن بىر تەرەپلىمە ئۆزگىرىش ئانالىزى ۋە تەكرارلانغان ئۆلچەملەرنى (*P<0.05 ۋە **P<0.01) ئىشلىتىڭ. كەم دېگەندە n = 3 مۇستەقىل سىناقتىن ئېلىنغان سانلىق مەلۇماتلارنى كۆرسىتىدۇ. (E دىن G غىچە) CD3/CD28 ۋە IL-2 T ھۈجەيرىلىرىنى ئۆزلىرىنىڭ MNA قويۇقلۇقىدا 7 كۈن ئاكتىپلاشتۇرۇش ئۈچۈن ئىشلىتىلدى. PMA/ئىئونومىسىن قوزغىتىشتىن 4 سائەت بۇرۇن ۋە كېيىن مۇھىت يىغىۋېلىندى. TNFα (E)، IFN-γ (F) ۋە IL-2 (G) نىڭ قويۇقلۇقى ELISA ئارقىلىق ئۆلچەندى. سىزىقلىق دىئاگرامما ئوتتۇرىچە قىممەتنى (n = 5 ساغلام ئىئانە قىلغۇچى) + SEM نى كۆرسىتىدۇ. P قىممىتى بىر تەرەپلىمە ئۆزگىرىش ئانالىزى ۋە قايتا-قايتا ئۆلچەش ئارقىلىق بېكىتىلىدۇ (*P<0.05). نۇقتا سىزىق بايقاشنىڭ بايقاش چېكىنى كۆرسىتىدۇ. (H) ھۈجەيرە پارچىلىنىش سىنىقى. FRα-CAR-T ياكى GFP-CAR-T ھۈجەيرىلىرى 24 سائەت ئادېنوزىن (250μM) ياكى MNA (10 mM) بىلەن تەڭشىلەندى، ياكى داۋالانمىدى (Ctrl). SK-OV-3 ھۈجەيرىلىرىنىڭ ئۆلتۈرۈش نىسبىتى ئۆلچەندى. P قىممىتى Welch t سىنىقى ئارقىلىق بېكىتىلدى (*P<0.5 ۋە **P<0.01).
MNA غا تايىنىدىغان TNFα ئىپادىلىنىش تەڭشىلىشىنى مېخانىزم جەھەتتىن چۈشىنىش ئۈچۈن، MNA بىلەن داۋالانغان T ھۈجەيرىلىرىنىڭ TNFα mRNA دىكى ئۆزگىرىشلەر باھالاندى (5A-رەسىم). MNA بىلەن داۋالانغان ساغلام ئىئانە قىلغۇچى T ھۈجەيرىلىرىدە TNFα ترانسكرىپسىيە سەۋىيەسى ئىككى ھەسسە ئاشتى، بۇ MNA نىڭ TNFα ترانسكرىپسىيە تەڭشىلىشىگە تايىنىدىغانلىقىنى كۆرسىتىدۇ. بۇ مۇمكىن بولغان تەڭشەش مېخانىزمىنى تەكشۈرۈش ئۈچۈن، TNFα نى تەڭشەيدىغان ئىككى داڭلىق ترانسكرىپسىيە ئامىلى، يەنى ئاكتىپلانغان T ھۈجەيرىسى يادرو ئامىلى (NFAT) ۋە ئالاھىدە ئاقسىل 1 (Sp1)، MNA نىڭ يېقىن TNFα تەشۋىقاتچىسىغا باغلىنىشىغا جاۋابەن باھالاندى (30). TNFα تەشۋىقاتچىسىدا 6 دانە NFAT باغلىنىش ئورنى ۋە 2 دانە Sp1 باغلىنىش ئورنى بار بولۇپ، بىر ئورۇندا قاپسىلىپ تۇرىدۇ [-55 ئاساس جۈپلىرى (bp) 5'cap دىن] (30). خروماتىن ئىممۇنىتېت چۆكمىسى (ChIP) MNA بىلەن داۋالانغاندا، Sp1 نىڭ TNFα تەشۋىقاتچىسىغا باغلىنىشى ئۈچ ھەسسە ئاشتى. NFAT نىڭ قوشۇلۇشىمۇ ئاشتى ۋە مۇھىملىققا يېقىنلاشتى (5B-رەسىم). بۇ سانلىق مەلۇماتلار MNA نىڭ Sp1 ترانسكرىپسىيەسى ئارقىلىق TNFα نىڭ ئىپادىلىنىشىنى، ۋە ئازراق دەرىجىدە NFAT نىڭ ئىپادىلىنىشىنى تەڭشەيدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
(A) MNAسىز يېتىشتۈرۈلگەن T ھۈجەيرىلىرى بىلەن سېلىشتۇرغاندا، MNA بىلەن داۋالانغان T ھۈجەيرىلىرىدىكى TNFα ئىپادىسىنىڭ قاتلىنىش ئۆزگىرىشى. SEM بىلەن ئىپادىلەش ئەندىزىسى كۆرسىتىلدى (n = 5 ساغلام ئىئانە قىلغۇچى). كەم دېگەندە n = 3 مۇستەقىل سىناقتىن ئېلىنغان سانلىق مەلۇماتلارنى ئىپادىلەيدۇ. (B) NFAT ۋە Sp1 دىن كېيىن 8 mM MNA بىلەن داۋالانغان ياكى داۋالانمىغان T ھۈجەيرىلىرىنىڭ TNFα ئىلگىرى سۈرگۈچىسى (Ctrl) ۋە PMA/ئىئونومىسىن بىلەن 4 سائەت بىرلەشتۈرۈلگەن. ئىممۇنىتېت چۆكمىسى ئۈچۈن ئايرىم-ئايرىم ھالدا مەنپىي ۋە مۇسبەت كونترول گۇرۇپپىسى سۈپىتىدە ئىممۇنىتېت گلوبۇلىن G (IgG) ۋە H3 ئىشلىتىلدى. ChIP نىڭ مىقدارلاشتۇرۇلۇشى MNA بىلەن داۋالانغان ھۈجەيرىلەردە Sp1 ۋە NFAT نىڭ TNFα ئىلگىرى سۈرگۈچىسىگە باغلىنىشى كونترول گۇرۇپپىسىغا سېلىشتۇرغاندا بىر قانچە ھەسسە ئاشقانلىقىنى كۆرسەتتى. كەم دېگەندە n = 3 مۇستەقىل سىناقتىن ئېلىنغان سانلىق مەلۇماتلارنى ئىپادىلەيدۇ. كۆپ قېتىملىق t سىنىقى ئارقىلىق بېكىتىلگەن P قىممىتى (*** P <0.01). (C) HGSC نىڭ ئاسسىتى بىلەن سېلىشتۇرغاندا، T ھۈجەيرىلىرى (سىتوتوكسىك ئەمەس) ئۆسمىدە TNF نىڭ ئىپادىسىنىڭ ئاشقانلىقىنى كۆرسەتتى. رەڭلەر ئوخشىمىغان بىمارلارنى ئىپادىلەيدۇ. كۆرسىتىلگەن ھۈجەيرىلەر تاسادىپىي ھالدا 300 گىچە ئەۋرىشكە ئېلىندى ۋە ئارتۇقچە تارتىشنى چەكلەش ئۈچۈن جىتتېرلاندى (** Padj = 0.0076). (D) تۇخۇمدان راكى ئۈچۈن MNA نىڭ تەكلىپ قىلىنغان مودېلى. MNA TME دىكى ئۆسمە ھۈجەيرىلىرى ۋە فىبروبلاستلاردا ئىشلەپچىقىرىلىدۇ ۋە T ھۈجەيرىلىرى تەرىپىدىن قوبۇل قىلىنىدۇ. MNA Sp1 نىڭ TNFα ئىلگىرى سۈرگۈچىسىگە باغلىنىشىنى ئاشۇرۇپ، TNFα ترانسكرىپسىيەسى ۋە TNFα سىتوكىن ئىشلەپچىقىرىشىنىڭ ئېشىشىغا سەۋەب بولىدۇ. MNA يەنە IFN-γ نىڭ تۆۋەنلىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ. T ھۈجەيرىسىنىڭ ئىقتىدارىنى چەكلەش ئۆلتۈرۈش ئىقتىدارىنى تۆۋەنلىتىدۇ ۋە ئۆسمە ئۆسۈشىنى تېزلىتىدۇ.
دوكلاتلارغا قارىغاندا، TNFα نىڭ ئالدى ۋە ئارقا تەرەپكە تايىنىدىغان ئۆسمىگە قارشى ۋە ئۆسمىگە قارشى تەسىرى بار، ئەمما ئۇ تۇخۇمدان راكىنىڭ ئۆسۈشى ۋە مېتاستازىنى ئىلگىرى سۈرۈشتە داڭلىق رول ئوينايدۇ (31-33). دوكلاتلارغا قارىغاندا، تۇخۇمدان راكى بىمارلىرىنىڭ ئاسسىت ۋە ئۆسمە توقۇلمىلىرىدىكى TNFα نىڭ قويۇقلۇقى ياخشى سۈپەتلىك توقۇلمىلارغا قارىغاندا يۇقىرى (34-36). مېخانىزم جەھەتتىن قارىغاندا، TNFα ئاق قان ھۈجەيرىلىرىنىڭ ئاكتىپلىشىشى، ئىقتىدارى ۋە كۆپىيىشىنى تەڭشەيدۇ ھەمدە راك ھۈجەيرىلىرىنىڭ فېنوتىپىنى ئۆزگەرتەلەيدۇ (37، 38). بۇ بايقاشلارغا ماس ھالدا، پەرقلىق گېن ئىپادىسى ئانالىزى شۇنى كۆرسەتتىكى، TNF ئۆسمە توقۇلمىلىرىدىكى T ھۈجەيرىلىرىدە ئاسسىتقا سېلىشتۇرغاندا كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە يۇقىرىلىغان (5C-رەسىم). TNF ئىپادىسىنىڭ ئېشىشى پەقەت سىتوتوكسىك بولمىغان فېنوتىپقا ئىگە T ھۈجەيرە توپلىرىدا روشەن كۆرۈلگەن (S5A-رەسىم). قىسقىسى، بۇ سانلىق مەلۇماتلار MNA نىڭ HGSC دا قوش ئىممۇنىتېت بېسىمى ۋە ئۆسمە ئىلگىرى سۈرۈش تەسىرىگە ئىگە ئىكەنلىكى توغرىسىدىكى قاراشنى قوللايدۇ.
ئېقىن سىتومېتىرىيەسىگە ئاساسلانغان فلۇئورېسسېنسىيە بەلگىسى TIL ماددا ئالمىشىشىنى تەتقىق قىلىشنىڭ ئاساسلىق ئۇسۇلىغا ئايلاندى. بۇ تەتقىقاتلار شۇنى كۆرسەتتىكى، پېرىفېرىيە قان لىمفا ھۈجەيرىلىرى ياكى ئىككىنچى دەرىجىلىك لىمفا ئەزالىرىدىن كەلگەن T ھۈجەيرىلىرى بىلەن سېلىشتۇرغاندا، چاشقان ۋە ئىنسانلارنىڭ TIL نىڭ گىليۇكوزا سۈمۈرۈش مايىللىقى يۇقىرى (4، 39) ۋە مىتوخوندىرىيە ئىقتىدارىنىڭ ئاستا-ئاستا يوقىلىشى (19، 40). بۇ تەتقىقاتتا ئوخشاش نەتىجىلەرنى كۆزەتكەن بولساقمۇ، ئاساسلىق تەرەققىيات راك ھۈجەيرىلىرىنىڭ ماددا ئالمىشىشى ۋە ئوخشاش كېسىۋېتىلگەن راك توقۇلمىسىدىن كەلگەن TIL نى سېلىشتۇرۇشتىن ئىبارەت. بۇ ئىلگىرىكى بەزى دوكلاتلارغا ماس ھالدا، ئاسسىت ۋە راكتىن كەلگەن راك (CD45-EpCAM +) ھۈجەيرىلىرىنىڭ گىليۇكوزا سۈمۈرۈش مىقدارى CD8 + ۋە CD4 + T ھۈجەيرىلىرىگە قارىغاندا يۇقىرى، بۇ راك ھۈجەيرىلىرىنىڭ يۇقىرى گىليۇكوزا سۈمۈرۈش مىقدارىنى T ھۈجەيرىلىرى بىلەن سېلىشتۇرۇشقا بولىدىغانلىقىنى قوللايدۇ. T ھۈجەيرىسى رىقابىتى ئۇقۇمى. TME. قانداقلا بولمىسۇن، راك ھۈجەيرىلىرىنىڭ مىتوخوندىرىيە پائالىيىتى CD8 + T ھۈجەيرىلىرىدىن يۇقىرى، ئەمما مىتوخوندىرىيە پائالىيىتى CD4 + T ھۈجەيرىلىرىنىڭكىگە ئوخشايدۇ. بۇ نەتىجىلەر ئوكسىدلىنىش مېتابولىزمىنىڭ راك ھۈجەيرىلىرى ئۈچۈن مۇھىم ئىكەنلىكى توغرىسىدىكى يېڭى تېمىنى كۈچەيتىدۇ (41، 42). ئۇلار يەنە CD8 + T ھۈجەيرىلىرىنىڭ CD4 + T ھۈجەيرىلىرىگە قارىغاندا ئوكسىدلىنىش ئىقتىدارىنىڭ تۆۋەنلىشىگە ئاسان ئۇچرايدىغانلىقىنى ياكى CD4 + T ھۈجەيرىلىرىنىڭ مىتوخوندىرىيە پائالىيىتىنى ساقلاش ئۈچۈن گلۇكوزادىن باشقا كاربون مەنبەلىرىنى ئىشلىتىشى مۇمكىنلىكىنى ئوتتۇرىغا قويدى (43، 44). شۇنى ئەسكەرتىش كېرەككى، بىز ئاسسىتتىكى CD4 + T ئۈنۈمچىسى، T ئۈنۈمچىسى خاتىرىسى ۋە T مەركىزىي خاتىرىسى ھۈجەيرىلىرى ئارىسىدا گلۇكوزا قوبۇل قىلىش ياكى مىتوخوندىرىيە پائالىيىتىدە ھېچقانداق پەرقنى كۆزەتمىدۇق. شۇنىڭغا ئوخشاش، ئۆسمىلەردىكى CD8 + T ھۈجەيرىلىرىنىڭ پەرقلىنىش ھالىتى گلۇكوزا قوبۇل قىلىشتىكى ئۆزگىرىشلەر بىلەن ھېچقانداق مۇناسىۋىتى يوق، بۇ سىناق نەيچىسىدە يېتىشتۈرۈلگەن T ھۈجەيرىلىرى بىلەن ئىنسانلارنىڭ TIL دىكى مۇھىم پەرقنى گەۋدىلەندۈرىدۇ (22). بۇ كۆزىتىشلەر يەنە ئادىل ئاپتوماتىك ھۈجەيرە توپىنى تەقسىملەش ئارقىلىق جەزملەشتۈرۈلدى، بۇ يەنە ئۆسمە ھۈجەيرىلىرىگە قارىغاندا گلۇكوزا قوبۇل قىلىش ۋە مىتوخوندىرىيە پائالىيىتى يۇقىرى بولغان CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + ھۈجەيرىلىرىنىڭ كۆپ ئۇچرايدىغانلىقىنى، ئەمما ماددا ئالمىشىش ئاكتىپ ھۈجەيرە توپىغا ئىگە ئىكەنلىكىنى ئاشكارىلىدى. بۇ توپ scRNA-seq ئانالىزىدا بايقالغان مىئېلوئىد باستۇرغۇچى ھۈجەيرىلەر ياكى پلازماسىتوئىد دېندىرىت ھۈجەيرىلىرىنىڭ پەرەز قىلىنغان تارماق توپىنى ئىپادىلىشى مۇمكىن. گەرچە بۇ ئىككىسى ئىنسان تۇخۇمدان ئۆسمىسىدە بايقالغان بولسىمۇ [45]، ئۇلار يەنىلا بۇ مىئېلوئىد كىچىك توپلىنىشىنى چۈشەندۈرۈش ئۈچۈن تېخىمۇ كۆپ تەتقىقات ئېلىپ بېرىشقا موھتاج.
ئېقىم سىتومېتىرىيەسىگە ئاساسلانغان ئۇسۇللار ھۈجەيرە تىپلىرى ئارىسىدىكى گىليۇكوزا ۋە ئوكسىدلىنىش مېتابولىزمىدىكى ئومۇمىي پەرقنى ئېنىقلىيالايدۇ، ئەمما TME دىكى مىتوخوندىرىيە مېتابولىزمى ئۈچۈن گىليۇكوزا ياكى باشقا كاربون مەنبەلىرى تەرىپىدىن ئىشلەپچىقىرىلغان ئېنىق مېتابولىتلار ھازىرغىچە ئېنىقلانمىدى. بېرىلگەن بىر TIL تارماق گۇرۇپپىسىغا مېتابولىتلارنىڭ بار-يوقلۇقىنى بېكىتىش ئۈچۈن، كېسىۋېتىلگەن توقۇلمىلاردىن ھۈجەيرە توپىنى تازىلاش تەلەپ قىلىنىدۇ. شۇڭا، بىزنىڭ ھۈجەيرە بايىتىش ئۇسۇلىمىز ماسسا سپېكترومېتىرىيەسى بىلەن بىرلەشتۈرۈلگەندە، بىمار ئەۋرىشكىلىرىدىكى T ھۈجەيرىلىرى ۋە ئۆسمە ھۈجەيرە توپلىرىدا پەرقلىق بايىغان مېتابولىتلار توغرىسىدا چۈشەنچە بېرەلەيدۇ. بۇ ئۇسۇل فلۇئورېسسېنسىيە ئارقىلىق ئاكتىپلاشتۇرۇلغان ھۈجەيرە تۈرگە ئايرىشقا قارىغاندا ئەۋزەللىككە ئىگە بولسىمۇ، بەزى مېتابولىت كۈتۈپخانىلىرى تەبىئىي مۇقىملىق ۋە/ياكى تېز ئايلىنىش سۈرئىتى سەۋەبىدىن تەسىرگە ئۇچرىشى مۇمكىن (22). شۇنداقتىمۇ، بىزنىڭ ئۇسۇلىمىز ئىككى ئېتىراپ قىلىنغان ئىممۇنىتېتنى باستۇرىدىغان مېتابولىت، ئادېنوزىن ۋە كىنۇرېنىننى بايقىيالىدى، چۈنكى ئۇلار ئەۋرىشكە تىپلىرى ئارىسىدا زور دەرىجىدە پەرقلىنىدۇ.
بىزنىڭ ئۆسمىلەر ۋە TIL تىپلىرىنىڭ مېتابونومىك ئانالىزىمىز تۇخۇمدان TME دىكى مېتابولىتلارنىڭ رولىنى تېخىمۇ چوڭقۇر چۈشىنىشكە ياردەم بېرىدۇ. بىرىنچىدىن، ئېقىم سىتومېتىرىيەسىنى ئىشلىتىپ، بىز ئۆسمىلەر بىلەن CD4 + T ھۈجەيرىلىرى ئارىسىدا مىتوخوندىرىيە پائالىيىتىدە پەرق يوقلۇقىنى بايقىدۇق. قانداقلا بولمىسۇن، LC-MS/MS ئانالىزى بۇ توپلار ئارىسىدىكى مېتابولىتلارنىڭ موللۇقىدا كۆرۈنەرلىك ئۆزگىرىشلەرنى بايقىدى، بۇ TIL مېتابولىزمى ۋە ئۇنىڭ ئومۇمىي مېتابولىزم پائالىيىتى توغرىسىدىكى يەكۈنلەرنىڭ ئەستايىدىل چۈشەندۈرۈشنى تەلەپ قىلىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. ئىككىنچىدىن، MNA ئۆسمىلەردە ئەمەس، بەلكى ئاسسىتتا CD45 ھۈجەيرىلىرى بىلەن T ھۈجەيرىلىرى ئارىسىدا ئەڭ چوڭ پەرقكە ئىگە مېتابولىت. شۇڭا، بۆلۈكلەرگە ئايرىش ۋە ئۆسمىنىڭ ئورنى TIL مېتابولىزمىغا ئوخشىمايدىغان تەسىر كۆرسىتىشى مۇمكىن، بۇ مەلۇم بىر مىكرو مۇھىتتىكى مۇمكىن بولغان ھەر خىللىقنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. ئۈچىنچىدىن، MNA ئىشلەپچىقارغۇچى ئېنزىم NNMT نىڭ ئىپادىلىنىشى ئاساسلىقى CAF بىلەنلا چەكلىنىدۇ، بۇ ئازراق دەرىجىدە ئۆسمە ھۈجەيرىلىرى، ئەمما ئۆسمىدىن كېلىپ چىققان T ھۈجەيرىلىرىدە بايقىغىلى بولىدىغان MNA سەۋىيىسى كۆزىتىلىدۇ. تۇخۇمدان CAF دا NNMT نىڭ ئارتۇق ئىپادىلىنىشى راكنى ئىلگىرى سۈرۈش رولىنى ئوينايدۇ، بۇنىڭ قىسمەن سەۋەبى CAF مېتابولىزمى، ئۆسمىگە تاجاۋۇز قىلىش ۋە مېتاستازنى ئىلگىرى سۈرۈشتۇر (27). TIL نىڭ ئومۇمىي سەۋىيىسى ئوتتۇراھال بولسىمۇ، CAF دىكى NNMT نىڭ ئىپادىسى راك گېنوم ئاتلاسى (TCGA) مېزېنخىما تۈرى بىلەن زىچ مۇناسىۋەتلىك بولۇپ، بۇ ناچار كېسەللىك پراكتىكىسى بىلەن مۇناسىۋەتلىك (27، 46، 47). ئاخىرىدا، MNA پارچىلىنىشىغا مەسئۇل بولغان AOX1 ئېنزىمىنىڭ ئىپادىسى CAF توپى بىلەنلا چەكلىنىدۇ، بۇ T ھۈجەيرىلىرىنىڭ MNA نى مېتابولىزم قىلىش ئىقتىدارىنىڭ يوقلۇقىنى كۆرسىتىدۇ. بۇ نەتىجىلەر بۇ بايقاشنى دەلىللەش ئۈچۈن تېخىمۇ كۆپ تەتقىقات ئېلىپ بېرىشقا توغرا كەلسىمۇ، T ھۈجەيرىلىرىدىكى MNA نىڭ يۇقىرى سەۋىيىسى ئىممۇنىتېت سىستېمىسىنىڭ بېسىمغا ئۇچرىشىنى كۆرسىتىدىغان CAF مىكرو مۇھىتىنىڭ بارلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىشى مۇمكىن دېگەن قاراشنى قوللايدۇ.
MNA توشۇغۇچىلىرىنىڭ ئىپادىلىنىش سەۋىيەسىنىڭ تۆۋەنلىكى ۋە MNA ماددا ئالمىشىشىغا قاتناشقان ئاساسلىق ئاقسىللارنىڭ بايقىغىلى بولمايدىغان سەۋىيىسىنى نەزەرگە ئالغاندا، T ھۈجەيرىلىرىدە MNA نىڭ بولۇشى كۈتۈلمىگەن ئىش. NNMT ۋە AOX1 نىڭ ھېچقايسىسى scRNA-seq ئانالىزى ۋە ئىككى مۇستەقىل گۇرۇپپىنىڭ نىشانلىق qPCR ئارقىلىق بايقىغىلى بولمىدى. بۇ نەتىجىلەر MNA نىڭ T ھۈجەيرىلىرى تەرىپىدىن سىنتېزلانمايدىغانلىقىنى، بەلكى ئەتراپتىكى TME دىن سۈمۈرۈلىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. سىناق نەيچىسىدىكى تەجرىبىلەر T ھۈجەيرىلىرىنىڭ سىرتقى MNA نى توپلاشقا مايىل ئىكەنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
بىزنىڭ سىناق نەيچىسىدىكى تەتقىقاتلىرىمىز شۇنى كۆرسەتتىكى، سىرتقى MNA T ھۈجەيرىلىرىدە TNFα نىڭ ئىپادىلىنىشىنى قوزغىتىدۇ ۋە Sp1 نىڭ TNFα ئىلگىرى سۈرگۈچىسىگە باغلىنىشىنى كۈچەيتىدۇ. TNFα نىڭ ھەم ئۆسمىگە قارشى تۇرۇش، ھەم ئۆسمىگە قارشى تۇرۇش رولى بولسىمۇ، تۇخۇمدان راكىدا، TNFα تۇخۇمدان راكىنىڭ ئۆسۈشىنى ئىلگىرى سۈرەلەيدۇ (31-33). تۇخۇمدان راكى ھۈجەيرىسى مەدەنىيىتىدە TNFα نىڭ نېيتراللىشىشى ياكى چاشقان مودېللىرىدا TNFα سىگنالىنى يوقىتىش TNFα ئارقىلىق ياللۇغلىنىش سىتوكىن ئىشلەپچىقىرىشنى ياخشىلاپ، ئۆسمىنىڭ ئۆسۈشىنى توسالايدۇ (32، 35). شۇڭلاشقا، بۇ خىل ئەھۋالدا، TME دىن ئېلىنغان MNA ئاپتوكرىن ھالقىسى ئارقىلىق TNFα غا تايىنىدىغان مېخانىزم ئارقىلىق ياللۇغلىنىشنى ئىلگىرى سۈرىدىغان مېتابولىت سۈپىتىدە رول ئوينايدۇ، شۇنىڭ بىلەن تۇخۇمدان راكىنىڭ پەيدا بولۇشى ۋە تارقىلىشىنى ئىلگىرى سۈرىدۇ (31). بۇ ئېھتىماللىققا ئاساسەن، TNFα توسۇشى تۇخۇمدان راكىنى داۋالاش ئۈچۈن مۇمكىن بولغان داۋالاش ۋاسىتىسى سۈپىتىدە تەتقىق قىلىنىۋاتىدۇ (37، 48، 49). بۇنىڭدىن باشقا، MNA CAR-T ھۈجەيرىلىرىنىڭ تۇخۇمدان راكى ھۈجەيرىلىرىگە بولغان سىتوتوكسىدلىق تەسىرىنى تۆۋەنلىتىدۇ، بۇ MNA ئارقىلىق ئىممۇنىتېتنى باستۇرۇشنىڭ تېخىمۇ كۆپ دەلىلىنى تەمىنلەيدۇ. بۇ نەتىجىلەر ئومۇمەن قىلىپ ئېيتقاندا، ئۆسمە ۋە CAF ھۈجەيرىلىرىنىڭ MNA نى ھۈجەيرە سىرتىدىكى TME غا ئاجرىتىپ چىقىرىدىغان مودېلنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. (i) TNF كەلتۈرۈپ چىقارغان تۇخۇمدان راكىنىڭ ئۆسۈشىنى قوزغىتىش ۋە (ii) MNA كەلتۈرۈپ چىقارغان T ھۈجەيرىسىنىڭ سىتوتوكسىك پائالىيىتىنى چەكلەش ئارقىلىق، بۇنىڭ قوش راك تەسىرى بولۇشى مۇمكىن (5D-رەسىم).
خۇلاسە قىلىپ ئېيتقاندا، بۇ تەتقىقات تېز سۈرئەتتە ھۈجەيرە بېيىتىش، يەككە ھۈجەيرە تەرتىپى ۋە ماددا ئالمىشىش پروفىلىنى بىرلەشتۈرۈش ئارقىلىق، HGSC بىمارلىرىدىكى ئۆسمە ۋە ئاسسىت ھۈجەيرىلىرى ئوتتۇرىسىدىكى زور ئىممۇنىتېت مېتابولومىك پەرقنى ئاشكارىلىدى. بۇ ئومۇميۈزلۈك ئانالىز T ھۈجەيرىلىرى ئارىسىدا گىليۇكوزا قوبۇل قىلىش ۋە مىتوخوندىرىيە پائالىيىتىدە پەرق بارلىقىنى كۆرسەتتى، ھەمدە MNA نىڭ ھۈجەيرە بولمىغان مۇستەقىل ئىممۇنىتېت تەڭشىگۈچ مېتابولىت ئىكەنلىكىنى ئېنىقلىدى. بۇ سانلىق مەلۇماتلار TME نىڭ ئىنسان راكىدىكى T ھۈجەيرىلىرىنىڭ ماددا ئالمىشىشىغا قانداق تەسىر كۆرسىتىدىغانلىقىغا تەسىر كۆرسىتىدۇ. T ھۈجەيرىلىرى بىلەن راك ھۈجەيرىلىرى ئوتتۇرىسىدىكى ئوزۇقلۇق ماددىلار ئۈچۈن بىۋاسىتە رىقابەت دوكلات قىلىنغان بولسىمۇ، مېتابولىتلار يەنە راكنىڭ تەرەققىياتىنى ئىلگىرى سۈرۈش ۋە ئېندوگېن ئىممۇنىتېت ئىنكاسىنى باستۇرۇش ئۈچۈن ۋاسىتىلىك تەڭشىگۈچ رولىنى ئوينايدۇ. بۇ تەڭشىگۈچ مېتابولىتلارنىڭ فۇنكسىيەلىك رولىنى تېخىمۇ تەپسىلىي چۈشەندۈرۈش راكقا قارشى ئىممۇنىتېت ئىنكاسىنى كۈچەيتىش ئۈچۈن باشقا ئىستراتېگىيەلەرنى ئېچىشى مۇمكىن.
بىمار ئەۋرىشكىلىرى ۋە كلىنىكىلىق سانلىق مەلۇماتلار كانادا توقۇلما ئامبىرى تورى تەرىپىدىن گۇۋاھنامە بېرىلگەن BC راك ئۆسمىسى توقۇلمىسى ئامبىرى ئارقىلىق قولغا كەلتۈرۈلدى. BC راك تەتقىقات ئەخلاق كومىتېتى ۋە برىتانىيە كولۇمبىيە ئۇنىۋېرسىتېتى (H07-00463) تەرىپىدىن تەستىقلانغان كېلىشىمگە ئاساسەن، بارلىق بىمارلارنىڭ ئەۋرىشكىلىرى ۋە كلىنىكىلىق سانلىق مەلۇماتلىرى يازما ماقۇللۇققا ئېرىشكەن ياكى رەسمىي ھالدا ماقۇللۇقىدىن ۋاز كەچكەن. ئەۋرىشكىلەر گۇۋاھنامە بېرىلگەن BioBank (BRC-00290) دا ساقلىنىدۇ. بىمارنىڭ تەپسىلىي ئالاھىدىلىكلىرى S1 ۋە S5 جەدۋەللىرىدە كۆرسىتىلدى. توڭلىتىش ئۈچۈن، بىمارنىڭ ئۆسمە ئەۋرىشكىسىنى مېخانىكىلىق پارچىلاش ئۈچۈن نېپىز پىچاق ئىشلىتىلىدۇ ۋە ئاندىن ئۇنى 100 مىكرونلۇق سۈزگۈچتىن ئۆتكۈزۈپ، يەككە ھۈجەيرە سۇسپېنزىيەسىنى ئالىدۇ. بىمارنىڭ ئاسسىتى 4 سېلسىيە گرادۇستا 1500 ئايلىنىش سۈرئىتىدە 10 مىنۇت مەركەزدىن قاچۇرۇلۇپ، ھۈجەيرىلەرنى پارچىلاپ، ئۈستۈنكى ماددىنى چىقىرىۋېتىدۇ. ئۆسمە ۋە ئاسسىتتىن ئېلىنغان ھۈجەيرىلەر %50 ئىسسىقلىق بىلەن ئاكتىپسىزلاندۇرۇلغان ئىنسان AB قان زەردابى (Sigma-Aldrich)، %40 RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) ۋە %10 دىمېتىل سۇلفوكسىدتا توڭلىتىپ ساقلانغان. بۇ ساقلانغان يەككە ھۈجەيرىلىك سۇسپېنزىيەلەر ئېرىتىلىپ، تۆۋەندە بايان قىلىنغان مېتابولىزم ۋە مېتابولىتنى ئېنىقلاش ئۈچۈن ئىشلىتىلگەن.
تولۇق سۇيۇقلۇق 0.22 μm سۈزۈلگەن 50:50 قوشۇلغان RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-گلۇتامىن (Thermo Fisher Scientific) قوشۇلغان، ئۇنىڭغا %10 ئىسسىقلىق بىلەن ئاكتىپسىزلاندۇرۇلغان ئىنسان AB قان زەردابى (Sigma-Aldrich)، 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific)، 2 mM l-گلۇتامىن (Thermo Fisher Scientific)، 1 x پېنىسىللىن سترېپتومىتسىن (PenStrep) ئېرىتمىسى (Thermo Fisher Scientific) ۋە 50 μMB-مېركاپتوئېتانول قوشۇلغان. AimV (Invitrogen) غا 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) ۋە 2 mM l-گلۇتامىن (Thermo Fisher Scientific) قوشۇلغان. ئېقىم سىتومېتىرىنىڭ رەڭ بېرىش بۇفېرى %3 ئىسسىقلىق بىلەن ئاكتىپسىزلاندۇرۇلغان AB ئىنسان قان زەردابى (Sigma) قوشۇلغان 0.22 μm سۈزۈلگەن فوسفات بۇفېرلانغان تۇز سۈيى (PBS; Invitrogen) قوشۇلغان. ھۈجەيرە بېيىتىش بۇفېرى 0.22μm سۈزۈلگەن PBS دىن تەركىب تاپقان بولۇپ، ئۇنىڭغا %0.5 ئىسسىقلىق بىلەن ئاكتىپسىزلاندۇرۇلغان ئىنسان AB زەردابى (Sigma-Aldrich) قوشۇلغان.
37 سېلسىيە گرادۇسلۇق تولۇق مۇھىتتا، ھۈجەيرىلەر 10 nM MT DR ۋە 100 μM 2-NBDG بىلەن 30 مىنۇت بوялدى. ئاندىن، ھۈجەيرىلەر 4 سېلسىيە گرادۇستا 15 مىنۇت eF506 ياشاشچانلىق بوياق بىلەن بوялدى. ھۈجەيرىلەرنى FC Block (eBioscience) ۋە Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) دا قايتا ئېرىتمە قىلىپ، ئېقىن سىتومېتىرى بوياش بوياق سۇيۇقلۇقىدا سۇيۇلدۇرۇڭ (ئىشلەپچىقارغۇچىنىڭ كۆرسەتمىسىگە ئاساسەن) ۋە ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 10 مىنۇت ئىنكۇباتسىيە قىلىڭ. ھۈجەيرىلەرنى بىر يۈرۈش ئانتىتېلا (S2 جەدۋىلى) بىلەن 4 سېلسىيە گرادۇسلۇق ئېقىن سىتومېتىرى بوياش بوياق سۇيۇقلۇقىدا 20 مىنۇت بوялتىڭ. تەھلىل قىلىشتىن بۇرۇن ھۈجەيرىلەرنى ئېقىن سىتومېتىرى بوياش بوياق سۇيۇقلۇقىدا (Cytek Aurora؛ 3L-16V-14B-8R سەپلىمىسى) قايتا ئېرىتمە قىلىپ ھۈجەيرە سانى سانلىق مەلۇماتلىرىنى تەھلىل قىلىڭ. ھۈجەيرە سانى سانلىق مەلۇماتلىرىنى تەھلىل قىلىش ئۈچۈن SpectroFlo ۋە FlowJo V10 نى ئىشلىتىڭ، سانلىق مەلۇماتنى يارىتىش ئۈچۈن GraphPad Prism 8 نى ئىشلىتىڭ. 2-NBDG ۋە MT DR نىڭ ئوتتۇرىچە فلۇئورېسسېنسىيە كۈچلۈكلۈكى (MFI) لوگافىرۇئېسسېنسىيە نورماللاشتۇرۇلدى، ئاندىن ماس كېلىدىغان بىمارلارنى ھېسابلاش ئۈچۈن جۈپلەشكەن t سىنىقى ستاتىستىكىلىق ئانالىز ئۈچۈن ئىشلىتىلدى. 40 ۋەقەدىن ئاز بولغان بارلىق توپلارنى ئانالىزدىن چىقىرىۋېتىڭ؛ ستاتىستىكىلىق ئانالىز ۋە سانلىق مەلۇماتلارنى كۆرسىتىشتىن بۇرۇن، ھەر قانداق مەنپىي قىممەت ئۈچۈن 1 MFI قىممىتىنى كىرگۈزۈڭ.
يۇقارقى جەريان تاختىسىنىڭ قولدا دەرۋازا قۇرۇش ئىستراتېگىيىسىنى تولۇقلاش ئۈچۈن، بىز FlowJo دىكى ئۆلۈك ھۈجەيرىلەرنى يوقاتقاندىن كېيىن ئاپتوماتىك ھالدا ھۈجەيرىلەرنى توپلامغا تەقسىم قىلىش ئۈچۈن شەكىل چەكلەش دەرىخى (FAUST) (21) نىڭ تولۇق ئىزاھاتىنى ئىشلەتتۇق. بىز خاتا تەقسىملەنگەندەك كۆرۈنىدىغان (PD1+ بىلەن PD1 ئۆسمە ھۈجەيرىلىرىنى بىرلەشتۈرۈش) ۋە ساقلىنىپ قالغان توپلاملارنى بىرلەشتۈرۈش ئۈچۈن چىقىرىشنى قولدا باشقۇرىمىز. ھەر بىر ئەۋرىشكە ئوتتۇرا ھېساب بىلەن %2 تىن ئارتۇق ھۈجەيرىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ، جەمئىي 11 توپلام.
فىكول گرادىيېنتى زىچلىق مەركىزىدىن قاچۇرۇش ئۇسۇلى ئارقىلىق PBMC نى لېيكوتسىت ئايرىش مەھسۇلاتلىرىدىن (STEMCELL Technologies) ئايرىش ئېلىپ بېرىلدى. CD8 + T ھۈجەيرىلىرى CD8 MicroBeads (Miltenyi) ئارقىلىق PBMC دىن ئايرىۋېلىندى ۋە ئىشلەپچىقارغۇچىنىڭ كۆرسەتمىسىگە ئاساسەن TransAct (Miltenyi) ئارقىلىق تولۇق مۇھىتتا 2 ھەپتە كېڭەيتىلدى. ھۈجەيرىلەر IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) بار تولۇق مۇھىتتا 5 كۈن تۇرغۇزۇلدى، ئاندىن TransAct بىلەن قايتا قوزغىتىلدى. 7-كۈنى، ئىشلەپچىقارغۇچىنىڭ كۆرسەتمىسىگە ئاساسەن، ئىنسان CD45 MicroBeads (Miltenyi) ئۈچ قېتىم ئارقا-ئارقىدىن ھۈجەيرىلەرنى بېيىتىش ئۈچۈن ئىشلىتىلدى. ھۈجەيرىلەر ئېقىم سىتومېتىرىيەسى ئانالىزى ئۈچۈن ئايرىۋېتىلدى (يۇقىرىدا تەسۋىرلەنگەندەك)، بىر مىليون ھۈجەيرە LC-MS/MS ئانالىزى ئۈچۈن ئۈچ قېتىم ئايرىۋېتىلدى. ئەۋرىشكىلەر تۆۋەندە تەسۋىرلەنگەندەك LC-MS/MS ئارقىلىق بىر تەرەپ قىلىندى. بىز يوقاپ كەتكەن مېتابولىت قىممىتىنى 1000 ئىئون سانى بىلەن مۆلچەرلىدۇق. ھەر بىر ئەۋرىشكە ئومۇمىي ئىئون سانى (TIC) ئارقىلىق نورماللاشتۇرۇلىدۇ، لوگارىفمىك ئايلاندۇرۇلىدۇ ۋە ئانالىز قىلىشتىن بۇرۇن MetaboAnalystR دا ئاپتوماتىك نورماللاشتۇرۇلىدۇ.
ھەر بىر بىمارنىڭ يەككە ھۈجەيرە سۇسپېنزىيەسى ئېرىتىلىپ، 40 μm سۈزگۈچ ئارقىلىق تولۇق مۇھىتقا سۈزۈلدى (يۇقىرىدا تەسۋىرلەنگەندەك). ئىشلەپچىقارغۇچىنىڭ قائىدىسىگە ئاساسەن، CD8+, CD4+ ۋە CD45-ھۈجەيرىلىرىنىڭ ئەۋرىشكىلىرىنى (مۇز ئۈستىدە) بايىتىش ئۈچۈن، MicroBeads (Miltenyi) ئارقىلىق ماگنىتلىق مونچاق ئايرىش ئارقىلىق ئۈچ قېتىم ئارقا-ئارقىدىن مۇسبەت تاللاش ئۇسۇلى قوللىنىلدى. قىسقىسى، ھۈجەيرىلەر ھۈجەيرە بايىتىش بۇفېرىغا قايتا سۇسپېنزىيە قىلىنىدۇ (يۇقىرىدا تەسۋىرلەنگەندەك) ۋە سانالىدۇ. ھۈجەيرىلەر ئىنسان CD8 مونچاقلىرى، ئىنسان CD4 مونچاقلىرى ياكى ئىنسان CD45 مونچاقلىرى (Miltenyi) بىلەن 4 سېلسىيە گرادۇستا 15 مىنۇت ئىنكۇباتسىيە قىلىندى، ئاندىن ھۈجەيرە بايىتىش بۇفېرى بىلەن يۇيۇلدى. ئەۋرىشكە LS ئىستونىدىن (Miltenyi) ئۆتكۈزۈلىدۇ، مۇسبەت ۋە مەنپىي كەسىرلەر يىغىۋېلىنىدۇ. ۋاقىتنى قىسقارتىش ۋە ھۈجەيرە ئەسلىگە كەلتۈرۈش باسقۇچىنى ئەڭ چوڭ دەرىجىدە ئاشۇرۇش ئۈچۈن، CD8-كەسىر CD4+ بايىتىشنىڭ ئىككىنچى باسقۇچىدا ئىشلىتىلىدۇ، CD4-كەسىر كېيىنكى CD45 بايىتىشتا ئىشلىتىلىدۇ. ئايرىش جەريانىدا ئېرىتمىنى مۇز ئۈستىدە ساقلاڭ.
مېتابولىت ئانالىزىغا ئۈلگە تەييارلاش ئۈچۈن، ھۈجەيرىلەر بىر قېتىم مۇزدەك تۇز ئېرىتمىسى بىلەن يۇيۇلدى، ھەمدە ھەر بىر ئۈلگىگە 1 مىللىلىتىر %80 مېتانول قوشۇلدى، ئاندىن ئارىلاشتۇرۇلۇپ، سۇيۇق ئازوتتا توڭلىتىلدى. ئۈلگىلەر ئۈچ قېتىم توڭلىتىش-ئېرىتىش دەۋرىگە ئۇچرىتىلدى ۋە 4 سېلسىيە گرادۇستا 15 مىنۇت 14000 ئايلىنىش سۈرئىتىدە مەركەزدىن قاچۇرۇلدى. مېتابولىتلارنى ئۆز ئىچىگە ئالغان ئۈستۈنكى سۇيۇقلۇق قۇرۇغۇچە پارغا ئايلاندۇرۇلدى. مېتابولىتلار 50 μl %0.03 لىك فورمىك كىسلاتادا قايتا ئېرىتىلىپ، ئارىلاشتۇرۇلۇپ، ئاندىن قالدۇق ماددىلار چىقىرىۋېتىلدى.
يۇقىرىدا دېيىلگەندەك مېتابولىتلارنى ئايرىۋېلىڭ. مېتابولومىك تەتقىقاتى ئۈچۈن ئۈستۈنكى قەۋەتنى يۇقىرى ئىقتىدارلىق سۇيۇقلۇق خروماتوگرافىيە بوتۇلكىسىغا يۆتكەڭ. تۈركۈم تەسىرىنىڭ ئالدىنى ئېلىش ئۈچۈن ھەر بىر ئەۋرىشكە ئوخشاش ساندىكى ھۈجەيرىلەر بىلەن تاسادىپىي داۋالاش كېلىشىمىنى ئىشلىتىڭ. بىز ئىلگىرى AB SCIEX QTRAP 5500 ئۈچ تۆت پوللۇق ماسسا سپېكترومېتىرىدا (50) ئېلان قىلىنغان دۇنياۋى مېتابولىتلارنىڭ سۈپەتلىك باھالىشىنى ئېلىپ باردۇق. خروماتوگرافىيە ئانالىزى ۋە چوققا رايونىنى بىرلەشتۈرۈش MultiQuant نەشرى 2.1 يۇمشاق دېتالى (Applied Biosystems SCIEX) ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى.
1000 ئىئون سانى يوقاپ كەتكەن مېتابولىت قىممىتىنى مۆلچەرلەش ئۈچۈن ئىشلىتىلدى، ھەر بىر ئەۋرىشكىنىڭ TIC قىممىتى ھەر بىر بايقالغان مېتابولىتنىڭ نورماللاشتۇرۇلغان چوققىسى كۆلىمىنى ھېسابلاش ئۈچۈن ئىشلىتىلدى، بۇ ئارقىلىق ئەۋرىشكىنى بىر تەرەپ قىلىش جەريانىدا ئەسۋاب ئانالىزى ئارقىلىق كىرگۈزۈلگەن ئۆزگىرىشلەرنى تۈزىتىشكە بولىدۇ. TIC نورماللاشتۇرۇلغاندىن كېيىن، MetaboAnalystR(51) (ئۆزلۈكىدىن بېكىتىلگەن پارامېتىر) لوگارىفمىك ئۆزگەرتىش ۋە ئاپتوماتىك نورمال سىزىق ئۆلچىمىنى كېڭەيتىش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدۇ. بىز ئەۋرىشكە تىپلىرى ئوتتۇرىسىدىكى مېتابولوم پەرقىنى تەكشۈرۈش ئانالىزى قىلىش ئۈچۈن ۋېگان R بوغچىسى بىلەن PCA نى ئىشلەتتۇق، ھەمدە بىمارلارنى ئانالىز قىلىش ئۈچۈن قىسمەن ئارتۇقچە ئانالىز ئىشلەتتۇق. ئەۋرىشكىلەر ئارىسىدىكى ئېۋكلىد ئارىلىقىنى توپلاش ئۈچۈن ئىسسىقلىق خەرىتىسى دېندروگراممىسىنى قۇرۇش ئۈچۈن ۋارد ئۇسۇلىنى قوللاندۇق. بىز پۈتۈن ھۈجەيرە تىپى ۋە مىكرو مۇھىتتا پەرقلىق مول مېتابولىتلارنى ئېنىقلاش ئۈچۈن ئۆلچەملىك مېتابولىت موللۇقىدا limma (52) نى ئىشلەتتۇق. چۈشەندۈرۈشنى ئاددىيلاشتۇرۇش ئۈچۈن، بىز مودېلنى بەلگىلەش ئۈچۈن گۇرۇپپا ئوتتۇرىچە پارامېتىرىنى ئىشلىتىمىز ۋە مىكرو مۇھىتتىكى ھۈجەيرە تىپلىرىنى ھەر بىر گۇرۇپپا (n = 6 گۇرۇپپا) سۈپىتىدە كۆزدە تۇتىمىز؛ مۇھىملىق سىنىقى ئۈچۈن، بىز ھەر بىر مېتابولىت ئۈچۈن ئۈچ قېتىم قايتا ئۆلچەش ئېلىپ باردۇق. خاتا كۆپىيىشنىڭ ئالدىنى ئېلىش ئۈچۈن، بىمار لىمما لايىھىسىگە توسالغۇ سۈپىتىدە كىرگۈزۈلدى. ھەر خىل بىمارلار ئوتتۇرىسىدىكى مېتابولىتلارنىڭ پەرقىنى تەكشۈرۈش ئۈچۈن، بىز بىمارلارنى ئۆز ئىچىگە ئالغان لىمما مودېلىنى مۇقىم ئۇسۇلدا تەڭشىدۇق. بىز ھۈجەيرە تىپى بىلەن Padj <0.05 مىكرو مۇھىتى ئوتتۇرىسىدىكى ئالدىن بېكىتىلگەن پەرقنىڭ مۇھىملىقىنى دوكلات قىلدۇق (بېنجامىنى-ھوچبېرگ تۈزىتىشى).
Miltenyi ئۆلۈك ھۈجەيرە يوقىتىش قورالى (>%80 ياشاشچانلىقى) ئارقىلىق كۈچلۈكلۈكنى بېيىتىشتىن كېيىن، 10x 5′گېن ئىپادىلەش كېلىشىمى ئارقىلىق پۈتۈن تىرىك توڭلىتىلغان ئاسسىت ۋە ئۆسمە ئەۋرىشكىلىرىدە بىر ھۈجەيرىلىك ترانسكرىپتوم تەرتىپلەش ئېلىپ بېرىلدى. ماس كېلىدىغان ئۆسمە ۋە ئاسسىت بار بەش ئەھۋال تەھلىل قىلىندى، گەرچە بىر ئۆسمە ئەۋرىشكىسىدىكى تۆۋەن ياشاشچانلىقى ئۇنىڭ كىرگۈزۈلۈشىگە توسقۇنلۇق قىلغان بولسىمۇ. كۆپ خىل بىمارلارنى تاللاش ئۈچۈن، بىز ھەر بىر بىمارنىڭ ئەۋرىشكىلىرىنى 10x خروم كونتروللىغۇچنىڭ يولىغا بىرلەشتۈرۈپ، ئاسسىت ۋە ئۆسمە ئورۇنلىرىنى ئايرىم تەھلىل قىلدۇق. تەرتىپلەشتىن كېيىن [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp جۈپلەشكەن ئۇچى (PE)، كۋېبېك گېنومى؛ ئۆسمە ۋە ئاسسىت ئۈچۈن ھەر بىر ھۈجەيرىگە ئوتتۇرا ھېساب بىلەن 73488 ۋە 41378 قېتىم ئوقۇش نەتىجىسىنى قولغا كەلتۈردۇق]]، بىز CellSNP ۋە Vireo (53) نى ئىشلەتتۇق (CellSNP غا ئاساسەن). GRCh38 تەمىنلىگەن ئادەتتىكى ئىنسان SNP (VCF) غا ئىئانە قىلغۇچىنىڭ كىملىكى بېكىتىلىدۇ. بىز بىمارنىڭ گېنوتىپ ھالىتى (IBS) نىڭ ئەڭ يېقىن كىملىكىنى (IBS) بېكىتىش ئۈچۈن SNPRelate نى ئىشلىتىمىز، بېكىتىلمىگەن ھۈجەيرىلەرنى ۋە قوش شەكىللىك دەپ ئېنىقلانغان ھۈجەيرىلەرنى ۋە ئاسسىت بىلەن ئۆسمە ئەۋرىشكىسى ئوتتۇرىسىدىكى ئىئانە قىلغۇچىلارنى چىقىرىۋېتىمىز (54). بۇ ۋەزىپىگە ئاساسەن، بىز ئۆسمە ۋە ئاسسىتتا مول ھۈجەيرە ۋەكىللىكىگە ئىگە ئۈچ ئەھۋالنى كېيىنكى تەھلىل ئۈچۈن ساقلاپ قالدۇق. تارقاقلاشتۇرغۇچ (55) ۋە سكان (56) BioConductor ئورالمىسىدا ماسسا سۈزۈش باسقۇچىنى ئىجرا قىلغاندىن كېيىن، تەھلىل ئۈچۈن 6975 ھۈجەيرە (ئوسما ۋە ئاسسىتتىن ئايرىم-ئايرىم ھالدا 2792 ۋە 4183 ھۈجەيرە) ھاسىل بولدى. بىز Jaccard ئارىلىقىغا ئاساسەن ئورتاق ئەڭ يېقىن قوشنا تورى (SNN) نىڭ igraph نىڭ (57) Louvain توپلاش ئۇسۇلىنى قوللىنىمىز. ئىپادىلەش ئۇسۇلى ئارقىلىق توپ ھۈجەيرىلىرى. توپلار قولدا بەلگە گېنىنىڭ ئىپادىلىنىشىغا ئاساسەن پەرەز قىلىنغان ھۈجەيرە تىپلىرىغا ئىزاھات بېرىلدى ۋە t-SNE ئارقىلىق كۆرسىتىلدى. سىتوتوكسىك T ھۈجەيرىلىرى CD8A ۋە GZMA نىڭ ئىپادىلىنىشى ئارقىلىق ئېنىقلىنىدۇ، رىبوسوما ئاقسىلىنىڭ ئىپادىلىنىشى تۆۋەن بولغان تارماق توپلارنى چىقىرىۋېتىدۇ. بىز Izar قاتارلىقلارنىڭ ئېلان قىلىنغان سانلىق مەلۇماتلىرىغا (16) ئېرىشتۇق، ئۇلارنىڭ t-SNE نىڭ كىرگۈزۈلۈشى ئىممۇنىتېت ھۈجەيرە بەلگىلىرى بىلەن NNMT ئىپادىسى ئوتتۇرىسىدىكى ئىپادىلەشنىڭ قاپلىنىشىنى كونترول قىلالايدۇ.
PBMC لېيكوتسىت ئايرىش مەھسۇلاتلىرىدىن (STEMCELL Technologies) فىكول گرادىيېنت زىچلىق مەركىزىدىن قاچۇرۇش ئۇسۇلى ئارقىلىق ئايرىلدى. CD3 + ھۈجەيرىلىرى CD3 مارجانلىرى (Miltenyi) ئارقىلىق PBMC دىن ئايرىلدى. MNA بار ياكى يوق ئەھۋال ئاستىدا، CD3 + ھۈجەيرىلىرى تاختا باغلانغان CD3 (5μg/ml)، ئېرىيدىغان CD28 (3μg/ml) ۋە IL-2 (300 U/ml; Proleukin) بىلەن ئاكتىپلاشتۇرۇلدى. كېڭىيىشنىڭ ئاخىرقى كۈنىدە، جانلىقلىق (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) ۋە كۆپىيىش (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) ئېقىم سىتومېتىرىيەسى ئارقىلىق باھالاندى. GolgiStop ئارقىلىق 4 سائەت PMA (20 ng/ml) ۋە ئىئونومىسىن (1μg/ml) بىلەن ھۈجەيرىلەرنى قوزغىتىش ئارقىلىق ئۈنۈم فۇنكسىيەسىنى باھالاڭ، ھەمدە CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) ۋە TNFα-فلۇئورېسسېئىن ئىزوتىئوسىئانات (FITC) (MAb11, BD) نى نازارەت قىلىڭ. qPCR ۋە ChIP ھۈجەيرىلىرىنى PMA (20 ng/ml) ۋە ئىئونومىسىن (1μg/ml) بىلەن 4 سائەت قوزغىتىش. ELISA ئۈستۈنكى سۇيۇقلۇقى PMA (20 ng/ml) ۋە ئىئونومىسىن (1μg/ml) بىلەن قوزغىتىشتىن ئىلگىرى ۋە كېيىن 4 سائەت يىغىۋېلىندى.
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) ئارقىلىق RNA نى ئايرىۋېلىش ئۈچۈن ئىشلەپچىقارغۇچىنىڭ قائىدىسىگە ئەمەل قىلىڭ. ئەۋرىشكەنى بىر خىل ھالەتكە كەلتۈرۈش ئۈچۈن QIAshredder (QIAGEN) ئىشلىتىڭ. تولۇقلىغۇچى DNA (cDNA) نى سىنتېز قىلىش ئۈچۈن يۇقىرى سىغىملىق RNA نى cDNA غا ئايلاندۇرۇش ئۈسكۈنىسى (Thermo Fisher Scientific) ئىشلىتىڭ. تۆۋەندىكى زوندلار بىلەن گېن ئىپادىسىنى مىقدارلاشتۇرۇش ئۈچۈن (ئىشلەپچىقارغۇچىنىڭ قائىدىسىگە ئاساسەن) TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) ئىشلىتىڭ: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [ھىدروگېندىن گلىتسېرالدېھىد-3-فوسفات (GAPDH)] ۋە Hs01010726_m1 (SLC22A2). بۇ ئۈلگىلەر MicroAmp ئوپتىكىلىق پىلاستىنكىسى بار MicroAmp تېز ئوپتىكىلىق 96-ئۆڭكۈرلۈك رېئاكسىيە تاختىسىدىكى StepOnePlus ھەقىقىي ۋاقىتلىق PCR سىستېمىسى (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) دا ئىجرا قىلىندى. 35 تىن ئاشقان ھەر قانداق Ct قىممىتى بايقاش چېكىدىن يۇقىرى دەپ قارىلىدۇ ۋە بايقالمايدۇ دەپ بەلگىلىنىدۇ.
ChIP نى ئىلگىرىكى تەسۋىرلەنگەندەك ئىجرا قىلىڭ (58). قىسقىسى، ھۈجەيرىلەر فورمالدېھىد (ئاخىرقى قويۇقلۇقى 1.42%) بىلەن بىر تەرەپ قىلىنىپ، ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 10 مىنۇت ئىنكۇباتسىيە قىلىندى. تولۇقلانغان شىشىش بۇفېرى (25 mM Hepes، 1.5 mM MgCl2، 10 mM KCl ۋە %0.1 NP-40) نى مۇز ئۈستىدە 10 مىنۇت ئىشلىتىڭ، ئاندىن (58) تەسۋىرلەنگەندەك ئىممۇنىتېت چۆكمىسى بۇفېرىدا قايتا ئېرىتىڭ. ئاندىن ئەۋرىشكە تۆۋەندىكى دەۋرىيلىكلەر بىلەن ئۇلترا ئاۋاز دولقۇنى ئارقىلىق تەكشۈرۈلدى: 10 دەۋرىيلىك (20 1 سېكۇنتلۇق ئىمپۇلس) ۋە 40 سېكۇنتلۇق ستاتىك ۋاقىت. ChIP دەرىجىلىك ئىممۇنىتېت گلوبۇلىن G (ھۈجەيرە سىگنال تېخنىكىسى؛ 1μl)، ھىستون H3 (ھۈجەيرە سىگنال تېخنىكىسى؛ 3μl)، NFAT (Invitrogen؛ 3μl) ۋە SP1 (ھۈجەيرە سىگنال تېخنىكىسى؛ 3μl) ئانتىتېلاسىنى ئەۋرىشكە بىلەن 4°CC تېمپېراتۇرىدا بىر كېچە سىلكىپ ئىنكۇباتسىيە قىلىڭ. A ئاقسىل مونچاقلىرىنى (Thermo Fisher Scientific) ئەۋرىشكىگە 4 سېلسىيە گرادۇستا 1 سائەت يېنىك سىلكىپ قويۇپ، ئاندىن DNA نى بېيىتىش ئۈچۈن chelex مونچاقلىرىنى (Bio-Rad) ئىشلىتىڭ، ئاقسىلنى ھەزىم قىلىش ئۈچۈن K ئاقسىل فېرمېنتىنى (Thermo Fisher) ئىشلىتىڭ. PCR ئارقىلىق TNFα پروموتېرى بايقالدى: ئالدىغا، GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT؛ ئەكسىچە، GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp مەھسۇلات). رەسىملەر Image Lab (Bio-Rad) تەرىپىدىن ئىشلەپچىقىرىلدى ۋە ImageJ يۇمشاق دېتالى ئارقىلىق مىقدارلاشتۇرۇلدى.
ھۈجەيرە يېتىشتۈرۈش ئۈستۈنكى سۇيۇقلۇقى يۇقىرىدا بايان قىلىنغاندەك يىغىۋېلىندى. ئېنىقلاش ئىشلەپچىقارغۇچىنىڭ ئىنسان TNFα ELISA قورالى (Invitrogen)، ئىنسان IL-2 ELISA قورالى (Invitrogen) ۋە ئىنسان IFN-γ ELISA قورالى (Abcam) نىڭ تەرتىپلىرىگە ئاساسەن ئېلىپ بېرىلدى. ئىشلەپچىقارغۇچىنىڭ قائىدىسىگە ئاساسەن، ئۈستۈنكى سۇيۇقلۇق TNFα ۋە IL-2 نى بايقاش ئۈچۈن 1:100 نىسبەتتە، IFN-γ نى بايقاش ئۈچۈن 1:3 نىسبەتتە سۇيۇقلاندۇرۇلدى. 450 نانومېتىردىكى سۈمۈرگۈچلۈكنى ئۆلچەش ئۈچۈن EnVision 2104 كۆپ بەلگە ئوقۇغۇچ (PerkinElmer) نى ئىشلىتىڭ.
PBMC لېيكوتسىت ئايرىش مەھسۇلاتلىرىدىن (STEMCELL Technologies) فىكول گرادىيېنت زىچلىق مەركىزىدىن قاچۇرۇش ئۇسۇلى ئارقىلىق ئايرىلدى. CD3 + ھۈجەيرىلىرى CD3 مارجانلىرى (Miltenyi) ئارقىلىق PBMC دىن ئايرىلدى. MNA بار ياكى يوق ئەھۋال ئاستىدا، CD3 + ھۈجەيرىلىرى تاختا باغلانغان CD3 (5μg/ml)، ئېرىيدىغان CD28 (3μg/ml) ۋە IL-2 (300 U/ml; Proleukin) بىلەن 3 كۈن ئاكتىپلاشتۇرۇلدى. 3 كۈندىن كېيىن، ھۈجەيرىلەر يىغىۋېلىنىپ، %0.9 تۇز سۈيى بىلەن يۇيۇلدى، ھەمدە دانچە توڭلىتىلدى. ھۈجەيرە سانى 123count eBeads ئارقىلىق ئېقىن سىتومېتىرىيەسى (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R سەپلىمىسى) ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى.
يۇقىرىدا بايان قىلىنغاندەك مېتابولىتلارنى ئېكىستراكت قىلىڭ. قۇرۇتۇلغان ئېكىستراكت 4000 ھۈجەيرە ئېكۋىۋالېنتى/μl قويۇقلۇقىدا قايتا ھاسىل قىلىندى. ئەۋرىشكە تەتۈر باسقۇچلۇق خروماتوگرافىيە (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ۋە CORTECS T3 ئىستون (2.1 × 150 mm, زەررىچە چوڭلۇقى 1.6-μm, تۆشۈك چوڭلۇقى 120-Å; #186008500, Waters) ئارقىلىق تەھلىل قىلىڭ. قۇتۇپ ماسسا سپېكترومېتىرى (6470, Agilent)، بۇ يەردە ئېلېكترو پۈركۈش ئىئونلىشىش مۇسبەت ھالەتتە ئىشلەيدۇ. ھەرىكەتچان A باسقۇچى %0.1 فورمىك كىسلاتا (H2O دا)، ھەرىكەتچان B باسقۇچى %90 ئاتسېتونىترىل، %0.1 فورمىك كىسلاتا. LC گرادىيېنتى %100 A ئۈچۈن 0 دىن 2 مىنۇتقىچە، %99 B ئۈچۈن 2 دىن 7.1 مىنۇتقىچە ۋە %99 B ئۈچۈن 7.1 دىن 8 مىنۇتقىچە بولىدۇ. ئاندىن ئىستوننى ھەرىكەتچان A باسقۇچى بىلەن 0.6 ml/min ئېقىم سۈرئىتىدە 3 مىنۇت قايتا تەڭشەڭ. ئېقىم سۈرئىتى 0.4 ml/min بولۇپ، ئىستون كامېراسى 50 سېلسىيە گرادۇسقىچە قىزىتىلىدۇ. ساقلاش ۋاقتى (RT) ۋە ئۆزگىرىشنى (RT = 0.882 مىنۇت، ئۆزگەرتىش 1 = 137→94.1، ئۆزگەرتىش 2 = 137→92، ئۆزگەرتىش 3 = 137→78) بېكىتىش ئۈچۈن MNA نىڭ ساپ خىمىيىلىك ئۆلچىمىنى (M320995، تورونتو تەتقىقات خىمىيىلىك شىركىتى، شىمالىي يورك، ئونتارىئو، كانادا) ئىشلىتىڭ. ئۈچ ئۆزگىرىشنىڭ ھەممىسى توغرا ساقلاش ۋاقتىدا يۈز بەرگەندە، ئۆزگىچەلىكنى كاپالەتلەندۈرۈش ئۈچۈن مىقدارلاشتۇرۇش ئۈچۈن 1-ئۆتكۈنچى ئىشلىتىلىدۇ. MNA (تورونتو تەتقىقات خىمىيە شىركىتى) نىڭ ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىقى زاپاس ئېرىتمىنى (1 mg/ml) ئالتە قېتىم سۇيۇلدۇرۇش ئارقىلىق ھاسىل قىلىندى، بۇ ئارقىلىق ئايرىم-ئايرىم ھالدا 0.1، 1.0، 10 ۋە 100 ng/ml ۋە 1.0 ۋە 10μg/ml سۇيۇقلۇق ئۆلچىمىگە ئېرىشكىلى بولىدۇ. بايقاش چېكى 1 ng/ml، سىزىقلىق جاۋاب 10 ng/ml بىلەن 10μg/ml ئارىلىقىدا بولىدۇ. LC/MS ئانالىزى ئۈچۈن ئىككى مىكرولىتىر ئەۋرىشكە ۋە ئۆلچەملىك ئەۋرىشكە ئىشلىتىلىدۇ، ئانالىز سۇپىسىنىڭ مۇقىملىقىغا كاپالەتلىك قىلىش ئۈچۈن ھەر سەككىز قېتىملىق ئوكۇلدا ئارىلاش سۈپەت كونترول ئەۋرىشكىسى ئىشلىتىلىدۇ. MNA بىلەن بىر تەرەپ قىلىنغان بارلىق ھۈجەيرە ئەۋرىشكىلىرىنىڭ MNA جاۋابى سىناقنىڭ سىزىقلىق دائىرىسى ئىچىدە بولدى. سانلىق مەلۇمات ئانالىزى MassHunter مىقدارلىق ئانالىز يۇمشاق دېتالى (v9.0, Agilent) ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى.
ئىككىنچى ئەۋلاد αFR-CAR قۇرۇلمىسى Song قاتارلىقلاردىن ئېلىندى (59). قىسقىسى، بۇ قۇرۇلما تۆۋەندىكى مەزمۇنلارنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ: CD8a باشلامچى تىزىملىكى، ئىنسانلارنىڭ αFR غا خاس يەككە زەنجىرلىك ئۆزگەرگۈچى پارچىسى، CD8a شارچىسى ۋە ترانسمېبران رايونى، CD27 ھۈجەيرە ئىچى رايونى ۋە CD3z ھۈجەيرە ئىچى رايونى. تولۇق CAR تىزىملىكى GenScript ئارقىلىق سىنتېزلىنىپ، ئاندىن ئۆتكۈزۈش ئۈنۈمىنى باھالاش ئۈچۈن ئىشلىتىلگەن GFP ئىپادىلەش كاسسىسىنىڭ ئالدىنقى ئېقىنىدىكى ئىككىنچى ئەۋلاد لېنتىۋىرۇس ئىپادىلەش ۋېكتورىغا كۆچۈرۈلدى.
لېنتىۋىرۇس HEK293T ھۈجەيرىلىرىنى [ئامېرىكا تىپىدىكى مەدەنىيەت توپلىمى (ATCC)] ترانسفېكسىيە قىلىش ئارقىلىق ئىشلەپچىقىرىلىدۇ؛ دۇلبېككونىڭ %10 ھامىلە كالا قان زەردابى (FBS) ۋە %1 PenStrep قوشۇلغان ئۆزگەرتىلگەن Eagle مۇھىتىدا ئۆستۈرۈلىدۇ، ھەمدە CAR-GFP ۋېكتورى ئىشلىتىلىدۇ. ئورالما پلازمىدلىرى (psPAX2 ۋە pMD2.G، Addgene) لىپوفېكسىيە ئامىنى (Sigma-Aldrich) نى ئىشلىتىدۇ. ۋىرۇس تەركىبىدىكى ئۈستۈنكى سۇيۇقلۇق ترانسفېكسىيە قىلىنغاندىن كېيىن 48 ۋە 72 سائەتتىن كېيىن يىغىۋېلىنىدۇ، سۈزۈلىدۇ ۋە ئۇلترا مەركەزدىن قاچۇرۇش ئارقىلىق قويۇقلاشتۇرۇلىدۇ. قويۇق ۋىرۇس ئۈستۈنكى سۇيۇقلۇقى ترانسفېكسىيە قىلىنغۇچە -80 سېلسىيە گرادۇستا ساقلىنىدۇ.
PBMC ساغلام ھوندېر لېيكوتسىت ئايرىش مەھسۇلاتلىرىدىن (STEMCELL Technologies) فىكول گرادىيېنت زىچلىق مەركىزىدىن قاچۇرۇش ئارقىلىق ئايرىلىدۇ. CD8+ ھۈجەيرىلىرىنى PBMC دىن ئايرىش ئۈچۈن مۇسبەت تاللاش CD8 مىكرو مونچاقلىرى (Miltenyi) نى ئىشلىتىڭ. TransAct (Miltenyi) ۋە TexMACS مۇھىتىدا [Miltenyi; %3 ئىسسىقلىق بىلەن ئاكتىپسىزلاندۇرۇلغان ئىنسان قان زەردابى، %1 PenStrep ۋە IL-2 (300 U/ml) قوشۇلغان] T ھۈجەيرىلىرىنى قوزغىتىڭ. قوزغىتىلغاندىن 24 سائەت كېيىن، T ھۈجەيرىلىرىگە lentivirus (ھەر 106 ھۈجەيرىگە 10 μl قويۇقلۇقتىكى ۋىرۇس ئۈستۈنكى سۇيۇقلۇقى) كىرگۈزۈلدى. Cytek Aurora دا (FSC (ئالدىغا چېچىلىش)/SSC (يان تەرەپكە چېچىلىش)، Singlet، GFP+ دا) كىرگۈزۈلگەندىن 1 كۈندىن 3 كۈنگىچە، ھۈجەيرىلەرنىڭ GFP ئىپادىسىنى باھالاپ، ئەڭ ئاز دېگەندە %30 لىك ئۆتكۈزۈش ئۈنۈمىنى كۆرسىتىڭ.
CAR-T ھۈجەيرىلىرى Immunocult (STEMCELL Technologies; 1% PenStrep قوشۇلغان) دا تۆۋەندىكى شەرتلەر ئاستىدا 24 سائەت يېتىشتۈرۈلدى: بىر تەرەپ قىلىنمىغان، 250 μM ئادېنوزىن ياكى 10 mM MNA بىلەن بىر تەرەپ قىلىنغان. ئالدىن بىر تەرەپ قىلىنغاندىن كېيىن، CAR-T ھۈجەيرىلىرى PBS بىلەن يۇيۇلۇپ، 10 دە 10% FBS ۋە 1% PenStrep قوشۇلغان 20،000 SK-OV-3 ھۈجەيرىسى [ATCC; McCoy 5A مۇھىتىدا (Sigma-Aldrich) بىرلەشتۈرۈلدى: 1 نىڭ ئۈنۈم بېرىش نىسبىتى تولۇقلانغان Immunocult مۇھىتىدا ئۈچ قېتىم كۈچەيتىلدى. digitalis saponin (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) بىلەن لىزىتلانغان SK-OV-3 ھۈجەيرىلىرى ۋە SK-OV-3 ھۈجەيرىلىرى ئايرىم-ئايرىم ھالدا مەنپىي ۋە مۇسبەت كونترول سۈپىتىدە ئىشلىتىلدى. 24 سائەت بىرلىكتە يېتىشتۈرۈلگەندىن كېيىن، ئۈستۈنكى سۇيۇقلۇق يىغىۋېلىندى ۋە ئىشلەپچىقارغۇچىنىڭ كۆرسەتمىسىگە ئاساسەن (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega) لاكتات دېھىدروگېنازا (LDH) ئۆلچەندى. LDH ئۈستۈنكى سۇيۇقلۇقى LDH بۇفېرىدا 1:50 سۇيۇلدۇرۇلدى. ئۆلتۈرۈش نىسبىتى تۆۋەندىكى فورمۇلا ئارقىلىق ئۆلچەندى: ئۆلتۈرۈش نىسبىتى = تۈزىتىش نىسبىتى / ئەڭ يۇقىرى ئۆلتۈرۈش نىسبىتى x 100%، بۇنىڭدا تۈزىتىش نىسبىتى = پەقەت بىرلىكتە يېتىشتۈرۈلگەن T ھۈجەيرىلىرى، ئەڭ يۇقىرى ئۆلتۈرۈش نىسبىتى = مۇسبەت كونترول-مەنپىي كونترول.
تېكىستتە ياكى ماتېرىياللار ۋە ئۇسۇللاردا بايان قىلىنغاندەك، ستاتىستىكىلىق ئانالىز ئۈچۈن GraphPad Prism 8، Microsoft Excel ياكى R v3.6.0 نى ئىشلىتىڭ. ئەگەر بىر بىماردىن كۆپ ئەۋرىشكە توپلانسا (مەسىلەن، ئاسسىت ۋە ئۆسمە)، بىز جۈپلەشكەن t سىنىقىنى ئىشلىتىمىز ياكى بىمارنى ماس ھالدا سىزىقلىق ياكى ئومۇملاشتۇرۇلغان مودېلغا تاسادىپىي ئۈنۈم سۈپىتىدە كىرگۈزىمىز. مېتابولومىك ئانالىز ئۈچۈن، مۇھىملىق سىنىقى ئۈچ قېتىم ئېلىپ بېرىلىدۇ.
بۇ ماقالىگە ئائىت قوشۇمچە ماتېرىياللار ئۈچۈن، http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 غا قاراڭ.
بۇ Creative Commons Attribution-Non-Commercial License شەرتلىرى بويىچە تارقىتىلغان ئوچۇق كىرىشلىك ماقالە بولۇپ، ئاخىرقى ئىشلىتىش سودا مەقسىتىدە بولمىغان ۋە ئەسلى ئەسەرنىڭ توغرا بولۇشى شەرت قىلىنغان ئەھۋالدا ھەر قانداق ۋاسىتە ئارقىلىق ئىشلىتىشكە، تارقىتىشقا ۋە كۆپەيتىشكە يول قويۇلىدۇ. پايدىلىنىش ئۈچۈن پايدىلىنىڭ.
ئەسكەرتىش: بىز پەقەت ئېلخەت ئادرېسىڭىزنى بېرىشىڭىزنى تەلەپ قىلىمىز، شۇنداق بولغاندا بەتكە تەۋسىيە قىلغان كىشى ئېلخەتنى كۆرۈشنى خالايدىغانلىقىڭىزنى ۋە ئۇنىڭ ئەخلەت ئەمەسلىكىنى بىلىدۇ. بىز ھېچقانداق ئېلخەت ئادرېسىنى خاتىرىلىمەيمىز.
بۇ سوئال سىزنىڭ زىيارەتچى ئىكەنلىكىڭىزنى سىناش ۋە ئاپتوماتىك ھالدا ئەخلەت ئۇچۇر يوللاشنىڭ ئالدىنى ئېلىش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدۇ.
مارىسا ك.كىلگور (مارىسا ك.كىلگور) ، سارا ماكفېرسون (سارا ماكفېرسون) ، لورېن گ. زاكارىياس (لاۋرېن گ. زاكارىياس) ، ئابىگايىل ئېلى ئارىس گ.
MNA T ھۈجەيرىلىرىنىڭ ئىممۇنىتېت كۈچىنى تۆۋەنلىتىشكە تۆھپە قوشىدۇ ھەمدە ئىنسان راكىنى داۋالاشتا ئىممۇنىتېت داۋالاش نىشانىنى كۆرسىتىدۇ.
مارىسا ك.كىلگور (مارىسا ك.كىلگور) ، سارا ماكفېرسون (سارا ماكفېرسون) ، لورېن گ. زاكارىياس (لاۋرېن گ. زاكارىياس) ، ئابىگايىل ئېلى ئارىس گ.
MNA T ھۈجەيرىلىرىنىڭ ئىممۇنىتېت كۈچىنى تۆۋەنلىتىشكە تۆھپە قوشىدۇ ھەمدە ئىنسان راكىنى داۋالاشتا ئىممۇنىتېت داۋالاش نىشانىنى كۆرسىتىدۇ.
© 2021 ئامېرىكا ئىلىم-پەننى ئىلگىرى سۈرۈش جەمئىيىتى. بارلىق ھوقۇقلار قوغدىلىدۇ. AAAS بولسا HINARI ، AGORA ، OARE ، CHORUS ، CLOCKSS ، CrossRef ۋە COUNTER نىڭ ھەمكارلاشقۇچىسى. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.