ئاقسىلنى ئايرىش يولىدىكى تۈرگە ئايرىش ھۈجەيرە بۆلۈنۈشى ۋە گومېئوستازنى ساقلاش ئۈچۈن ئىنتايىن مۇھىم. قېپىق ئارقىلىق تۈرگە ئايرىشتىن باشقا، كىنېسىننى ئايرىشتىكى لىپىدلارنىڭ رولى، ئايرىش توشۇش جەريانىدا ھازىرغىچە جاۋاب بېرىلمىگەن ئۇزۇن مۇددەتلىك ئاساسلىق سوئال. بۇ يەردە، بىز 3D بىرلا ۋاقىتتا كۆپ رەڭلىك يۇقىرى ئېنىقلىقتىكى ھەقىقىي ۋاقىتلىق سۈرەتكە تارتىش ئارقىلىق، ناھايىتى ئۇزۇن سېرامىد لىپىد بۆلەكلىرىگە ئىگە يېڭى بىرىكتۈرۈلگەن گلىكوسىلفوسفاتىدىلىنوزىتول-ئىممىباتسىيە قىلىنغان ئاقسىللارنىڭ توپلىنىپ، ئالاھىدە ئېندوپلازما تور چىقىش ئورنىغا تۈرگە ئايرىلغانلىقىنى، بۇ بولسا ترانسمېبرانا ئاقسىللىرى ئىشلىتىدىغان يەردىن پەرقلىنىدىغانلىقىنى ئىسپاتلايمىز. بۇنىڭدىن باشقا، بىز ئېندوپلازما تور پەردىسىدىكى سېرامىدنىڭ زەنجىر ئۇزۇنلۇقىنىڭ بۇ تۈرگە ئايرىش تاللاشچانلىقى ئۈچۈن مۇھىم ئىكەنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىمىز. بىزنىڭ تەتقىقاتىمىز ئاقسىل يۈكلىرىنى لىپىد زەنجىر ئۇزۇنلۇقىغا ئاساسەن ئايرىش يولىدىكى تاللاش خاراكتېرلىك ئېكسپورت ئورنىغا تۈرگە ئايرىشنىڭ تۇنجى بىۋاسىتە تىرىك دەلىلىنى تەمىنلەيدۇ.
ئېۋكارىئوت ھۈجەيرىلىرىدە، ئېندوپلازمىك توردا (ER) سىنتېزلانغان ئاقسىللار ھۈجەيرە مەنزىلىگە يەتكۈزۈش ئۈچۈن ئاجرىتىش يولى ئارقىلىق توشۇش جەريانىدا تۈرگە ئايرىلىدۇ (1). قاپاق ئارقىلىق تۈرگە ئايرىشتىن باشقا، بەزى مايلارنىڭ مەلۇم ئاقسىللارنىڭ مەلۇم پەردە رايونلىرىغا توپلىنىشى ئارقىلىق تاللاش خاراكتېرلىك چىقىش نۇقتىسى سۈپىتىدە خىزمەت قىلالايدىغانلىقى ئۇزۇندىن بۇيان پەرەز قىلىنىپ كەلگەن (2-5). قانداقلا بولمىسۇن، بۇ مايغا ئاساسلانغان مېخانىزمنى ئىسپاتلايدىغان بىۋاسىتە تىرىك جانلىق دەلىللىرى يەنىلا كەمچىل. بۇ ئاساسىي مەسىلىنى ھەل قىلىش ئۈچۈن، بىز خېمىردا گلىكوسىلفوسفاتىدىلىنوسىتول (GPI) لەڭگەرلىك ئاقسىللىرىنىڭ (GPI-APs) ER دىن قانداق قىلىپ پەرقلىق ھالدا چىقىرىلىدىغانلىقىنى تەتقىق قىلدۇق. GPI-APs مايغا باغلىنىدىغان ھۈجەيرە يۈزى ئاقسىللىرىنىڭ بىر خىل تۈرى (6، 7). GPI-AP بولسا گلىكولىپىد بۆلىكى (GPI لەڭگىرى) ئارقىلىق پلازما پەردىسىنىڭ سىرتقى ياپراقچىلىرىغا چاپلانغان ئاجرىتىلغان ئاقسىل. ئۇلار GPI لەڭگەرلىرىنى ER بوشلۇقىدىكى كونسېرۋاتىپ كېيىنكى تەرجىمە ئۆزگىرىشى سۈپىتىدە قوبۇل قىلىدۇ (8). چاپلانغاندىن كېيىن، GPI-AP گولگى ئاپپاراتى (5، 9) ئارقىلىق ER دىن پلازما پەردىسىگە ئۆتىدۇ. GPI لەڭگەرلىرىنىڭ مەۋجۇتلۇقى GPI-AP نىڭ سىرلاش يولى ئارقىلىق پەردە ئارقىلىق ئاجرىتىلغان ئاقسىللاردىن (باشقا پلازما پەردە ئاقسىللىرىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ) ئايرىم توشۇلىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ (5، 9، 10). ئېچىتقۇ ھۈجەيرىلىرىدە، GPI-AP لار ئېندوپلازمىك توردا باشقا ئاجرىتىلغان ئاقسىللاردىن ئايرىلىدۇ، ئاندىن قاپاق ئاقسىل كومپلېكسى II (COPII) بىلەن ئورالغان ئۆزگىچە كۆپۈكچىلەرگە ئورالىدۇ (6، 7). ER ئېكسپورت جەريانىدىكى بۇ تۈرگە ئايرىش جەريانىنىڭ بەلگىلىگۈچىلىرى ئېنىق ئەمەس، ئەمما بۇ مېخانىزمنىڭ مايلارنى، بولۇپمۇ GPI لەڭگىرىنىڭ ماي قىسمىنىڭ قۇرۇلمىنى ئۆزگەرتىشنى تەلەپ قىلىشى مۇمكىن دەپ پەرەز قىلىنماقتا (5، 8). ئېچىتقۇدا، GPI مايلىرىنىڭ قايتا ياسىلىشى GPI چاپلانغاندىن كېيىن دەرھال باشلىنىدۇ، نۇرغۇن ئەھۋاللاردا، ئۇ سېرامىدنىڭ 26 كاربونلۇق ئۇزۇن زەنجىرلىك تويۇنغان ياغ كىسلاتاسىغا (C26:0) باغلىنىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ (11، 12). C26 سېرامىد ھازىرغىچە ئېچىتقۇ ھۈجەيرىلىرى ئىشلەپچىقارغان ئاساسلىق سېرامىد. ئۇ ER دا سىنتېزلىنىدۇ ۋە كۆپ قىسمى COPII ۋېزىكچىلىرى ئارقىلىق گولگى ئاپپاراتىغا ئېكسپورت قىلىنىدۇ (13). GPI-AP نىڭ ER ئېكسپورتى ئۈچۈن، بولۇپمۇ داۋاملىق سېرامىد سىنتېزى تەلەپ قىلىنىدۇ (14، 15)، ھەمدە گولگى ئاپپاراتىدا سېرامىدنىڭ ئىنوزىتول فوسفات سېرامىدقا (IPC) ئايلىنىشى GPI لەڭگەر سىنتېزىغا باغلىق (16). سۈنئىي پەردىلەر بىلەن ئېلىپ بېرىلغان بىئوفىزىكىلىق تەتقىقاتلار شۇنى كۆرسەتتىكى، ئۇزۇن ئاتسىل زەنجىرلىك سېرامىدلار بىرلىشىپ، ئۆزگىچە فىزىكىلىق خۇسۇسىيەتكە ئىگە تەرتىپلىك دائىرىلەرنى ھاسىل قىلالايدۇ (17، 18). بۇ سانلىق مەلۇماتلار C26 سېرامىد ۋە GPI-AP نىڭ C26 سېرامىد بىلەن فىزىكىلىق خۇسۇسىيەتلىرىنى ئىشلىتىپ، نىسبەتەن قالايمىقان ER پەردىسى لىپىد مۇھىتىدا تەرتىپلىك رايونلارغا ياكى رايونلارغا بىرلىشىدۇ دېگەن پەرەزنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ. ئۇ ئاساسلىقى قىسقا ۋە تويۇنمىغان گلىتسېرولىپىدلاردىن تەركىب تاپقان (C16:1 ۋە C18:1) (19، 20). بۇ رايونلار مەخسۇس ER چىقىش نۇقتىلىرىغا (ERES) تاللاپ مەركەزلىشىدۇ، بۇ يەردە سېرامىد ۋە سېرامىد ئاساسلىق GPI-AP ئوخشاش مەخسۇس COPII ۋېزىكىسىدا گولگىغا بىرلىكتە يەتكۈزۈلىدۇ (5).
بۇ تەتقىقاتتا، بىز بۇ مايغا ئاساسلانغان مېخانىزمنى بىۋاسىتە سىناق قىلدۇق، بۇ مىكروسكوپ تېخنىكىسى يۇقىرى ئېنىقلىقتىكى كونفوكال رېئال ۋاقىتلىق سۈرەتكە ئېلىش مىكروسكوپى (SCLIM) ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى، بۇ مىكروسكوپ تېخنىكىسى فلۇئورېسسېنسىيەلىك بەلگە قويۇلغان ئاقسىللارنى بىرلا ۋاقىتتا كۆزىتەلەيدۇ. ئۈچ رەڭلىك ۋە ئۈچ ئۆلچەملىك (3D) سۈرەتلەر تىرىك ھۈجەيرىلەردە ئىنتايىن يۇقىرى ئېنىقلىق ۋە سۈرئەتكە ئىگە (21، 22).
بىز ئالدى بىلەن SCLIM تېخنىكىسىنى قوللىنىپ، S. cerevisiae دىكى ER دىن ئايرىلغاندىن كېيىن، C26 سېرامىد گۇرۇپپىسى بار نورمال GPI-AP نىڭ قانداق قىلىپ پەردە ئارقىلىق ئاجرىتىلغان ئاقسىللاردىن تەكشۈرۈلگەنلىكىنى تېخىمۇ ئېنىقلىدۇق. ER نىڭ تۈرگە ئايرىلىشىنى تەكشۈرۈش ئۈچۈن، بىز تىرىك جانلىقلاردا ERES غا كىرگەن يېڭى سىنتېزلانغان يۈكلەرنى بىۋاسىتە كۆرەلەيدىغان گېن سىستېمىسىنى ئىشلەتتۇق (7، 23). يۈك سۈپىتىدە، بىز يېشىل فلۇئورېسسېنت ئاقسىلى (GFP) بىلەن بەلگە قويۇلغان C26 سېرامىد ئاساسلىق GPI-AP Gas1 ۋە يېقىن ئىنفىرا قىزىل فلۇئورېسسېنت ئاقسىلى (iRFP) بىلەن بەلگە قويۇلغان پەردە ئارقىلىق ئاجرىتىلغان Mid2 ئاقسىلىنى تاللىدۇق، بۇ ئىككى ئاقسىل پلازما پەردىسىنى نىشان قىلىدۇ (24-26). sec31-1 تېمپېراتۇرىغا سەزگۈر مۇتانتتا، بۇ ئىككى يۈك گالاكتوزا قوزغىتىدىغان پروموتېر ۋە تەركىبلىك ERES بەلگىسى ئاستىدا ئىپادىلىنىدۇ. ئەڭ يۇقىرى تېمپېراتۇرىدا (37°C)، sec31-1 مۇتاتسىيەسى COPII قاپلاش تەركىبى Sec31 نىڭ COPII نىڭ ئۈنۈشى ۋە ER نىڭ سىرتقا چىقىرىلىشىنى توسۇش رولىغا تەسىر كۆرسىتىدىغانلىقتىن، يېڭى سىنتېزلانغان يۈكلەر ER دا توپلىنىدۇ (23). تۆۋەن تېمپېراتۇرىغا (24°C) سوۋۇغاندىن كېيىن، sec31-1 مۇتانت ھۈجەيرىلىرى ئاجرىلىپ چىقىش رايونىدىن ئەسلىگە كەلدى، توپلانغان يېڭى سۈنئىي يۈكلەر ER دىن سىرتقا چىقىرىلىشقا باشلىدى. CLIM كۆرۈنۈشىدىن قارىغاندا، يېڭىدىن سىنتېزلانغان Gas1-GFP ۋە Mid2-iRFP نىڭ كۆپ قىسمى 37°C دا ئىنكۇباتسىيە قىلىنىپ، ئاندىن 24°C دا 5 مىنۇت قويۇپ بېرىلگەندىن كېيىنمۇ sec31-1 مۇتانت ھۈجەيرىلىرىنىڭ ER دا توپلانغان (1-رەسىم). Mid2-iRFP پۈتۈن ER پەردىسىگە تارقالغان، Gas1-GFP بولسا ئۈزۈلگەن ER پەردە رايونىدا مەركەزلەشكەن ۋە توپلانغان بولغاچقا، ئۇلارنىڭ تارقىلىشى پۈتۈنلەي ئوخشىمايدۇ (1-رەسىم، A دىن C غىچە ۋە Movie S1). بۇنىڭدىن باشقا، 1D-رەسىمدە كۆرسىتىلگەندەك، Gas1-GFP توپىدا Mid2-iRFP يوق. بۇ نەتىجىلەر GPI-AP ۋە ترانسمېمبران ئاقسىللىرىنىڭ بالدۇرلا ئوخشىمىغان ER پەردە رايونلىرىغا ئايرىلغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. Gas1-GFP توپى mCherry نىڭ COPII قاپاق ئاقسىلى Sec13 (1-رەسىم، E ۋە F، ۋە S1 فىلىمى) ​​بىلەن بەلگە قويۇلغان ئالاھىدە ERES بىلەن قوشنا (23).
sec31-1 ھۈجەيرىلىرى گالاكتوزا قوزغىغان ئاجرىلىپ چىقىرىشلارنى ئىپادىلەيدۇ، ئۇزۇن ئاتسىل زەنجىرى (C26) سېرامىد GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP، يېشىل) ۋە ترانسمېبران ئاقسىلى Mid2-iRFP (TMP، كۆك) ۋە بۇ قۇرۇلمىلىق ERES بەلگىسى Sec13-mCherry (ERES، قىزىل) 37°C تېمپېراتۇرىدا 30 مىنۇت ئىنكۇباتسىيە قىلىندى، 24°C غا يۆتكەلدى ۋە 5 مىنۇتتىن كېيىن SCLIM ئارقىلىق سۈرەتكە ئېلىندى. (A دىن C غىچە) تەكشىلىكنىڭ ۋەكىللىك بىرلەشتۈرۈلگەن ياكى يەككە 2D سۈرىتىنى (A)، 10 z-كېسىمنىڭ 2D پرويېكسىيە سۈرىتىنى (B) ياكى يۈك ۋە ERES بەلگىلىرىنىڭ 3D ھۈجەيرە يېرىم شار سۈرىتىنى (C) كۆرسىتىدۇ. كۆلەم بالداق 1μm (A ۋە B). كۆلەم بىرلىكى 0.551μm (C). Gas1-GFP ئايرىم ER رايونلىرىدا ياكى توپلاردا بايقالغان، Mid2-iRFP بولسا ER پەردىسىگە بايقالغان ۋە تارقالغان (C). (D) گىرافىك ئاق ئوق سىزىقى (سول تەرەپ) بويىدىكى Gas1-GFP توپىدىكى Gas1-GFP ۋە Mid2-iRFP نىڭ نىسپىي فلۇئورېسسېنسىيە كۈچلۈكلۈكىنى كۆرسىتىدۇ. AU، خالىغان بىرلىك. (E ۋە F) ماللار ۋە ERES بەلگىسىنى بىرلەشتۈرگەن 3D رەسىمنى ئىپادىلەيدۇ. Gas1-GFP توپلىرى كونكرېت ERES نىڭ يېنىدا بايقالغان. كۆلەم بىرلىكى 0.551μm. (F) ئاق قاتتىق ئوق ERES بىلەن مۇناسىۋەتلىك Gas1-GFP توپىنى كۆرسىتىدۇ. ئوتتۇرا ۋە ئوڭ تاختىلار بىرلەشتۈرۈلگەن چوڭايتىلغان 3D رەسىمنى ۋە تاللانغان Gas1-GFP توپىنىڭ ئايلانما كۆرۈنۈشىنى كۆرسىتىدۇ.
Gas1-GFP توپى بىلەن مەلۇم بىر ERES ئوتتۇرىسىدىكى زىچ بوشلۇق مۇناسىۋىتى Gas1-GFP نىڭ تاللاشچان ERES غا كىرەلەيدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ، بۇ Mid2-iRFP نىڭ ER دىن چىقىش ئۈچۈن ئىشلەتكەن تاللاشچانلىقىدىن پەرقلىنىدۇ. بۇ ئېھتىماللىقنى ھەل قىلىش ئۈچۈن، بىز پەقەت بىر ياكى ئىككى تاۋارنىڭ ERES نىسبىتىنى مىقدارلاشتۇردۇق (2-رەسىم، A دىن C غىچە). بىز كۆپىنچە ERES (70%) پەقەت بىرلا خىل يۈكنى ئۆز ئىچىگە ئالىدىغانلىقىنى بايقىدۇق. 2C-رەسىمنىڭ ئاستىنقى رەسىمىدە پەقەت Gas1-GFP (1-رەسىم) ياكى پەقەت Mid2-iRFP (2-رەسىم) بار ERES نىڭ ئىككى تىپىك مىسالى كۆرسىتىلگەن. ئەكسىچە، تەخمىنەن ERES نىڭ %20 ى ئوخشاش رايوندا قاپسىلىپ تۇرىدىغان ئىككى يۈكنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ. بەزى ERES (%10) نىڭ ئىككى خىل يۈكنى ئۆز ئىچىگە ئالىدىغانلىقى، ئەمما ئۇلارنىڭ ئېنىق پەرقلىق رايونلاردا ئايرىلغانلىقى بايقالغان. شۇڭا، بۇ ستاتىستىكىلىق ئانالىز شۇنى كۆرسىتىپ بېرىدۇكى، ER ئېكسپورت قىلىنغاندىن كېيىن، GPI-AP Gas1-GFP ۋە Mid2-iRFP دىن باشقا ERES لارغا بۆلۈنىدۇ (2D-رەسىم). بۇ تۈرگە ئايرىش ئۈنۈمى ئىلگىرىكى بىئوخىمىيىلىك ئانالىز (6) ۋە مورفولوگىيەلىك ئېنىقلاش (7) بىلەن ئىنتايىن ماس كېلىدۇ. بىز يەنە كارانتىن قىلىنغان يۈكلەرنىڭ ERES غا كىرىش ھەرىكىتىنى كۆزىتىمىز (2E-رەسىم ۋە S2 فىلىمى). 2E-رەسىمدە Gas1-GFP (3-پانېل) ياكى Mid2-iRFP (4-پانېل) نىڭ پەقەت ئاز بىر قىسمىنىڭ ERES غا بىر تەرەپتىن كىرىپ، ئايرىم رايوندا چەكلەنگەنلىكى كۆرسىتىلگەن. 2E-رەسىمنىڭ 5-پانېلىدا Gas1-GFP ۋە Mid2-iRFP نىڭ بەزىدە ئوخشاش ERES دا ئۇچرايدىغانلىقى، ئەمما ئۇلار ئوخشىمىغان تەرەپلەردىن كىرىپ، ئوخشىمىغان COPII غا ئوخشاش ئايرىم رايونلارغا مەركەزلەشكەنلىكى كۆرسىتىلگەن. بىز يەنە C26 سېرامىد ئاساسلىق GPI-AP Gas1 نىڭ تاللاشچان ERES دەپ ئايرىلىشى ۋە تۈرگە ئايرىلىشىنىڭ ئالاھىدە ئىكەنلىكىنى جەزملەشتۈردۇق، چۈنكى يەنە بىر پەردە ئارقىلىق ئاجرىتىلىدىغان يۈك، GFP بەلگىسى قويۇلغان پلازما پەردە ئاقسىلى Axl2 (27)، Mid2-iRFP غا ئوخشاش ھەرىكەتنى كۆرسىتىدۇ. (S1-رەسىم ۋە S3 فىلىمى). يېڭى سىنتېزلانغان Axl2-GFP ER پەردىسى ئارقىلىق Mid2-iRFP غا ئوخشاش تارقىلىدۇ (S1، A ۋە B رەسىملىرى)، ھەمدە كۆپىنچە ERES لاردا Mid2-iRFP بىلەن بىرلىكتە ئورۇنلىشىدۇ (S1، B دىن D گىچە رەسىملەر). 1-رەسىمنىڭ 1- ۋە 2- جەدۋەللىرى. S1C ئىككى خىل پەردە ئارقىلىق يۈكنىڭ قاپسىلىپ كېتىدىغان ERES نىڭ ئىككى تىپىك مىسالىنى كۆرسىتىدۇ. بۇ خىل ئەھۋاللاردا، ئىككىلا مال ERES غا بىللە كىرىدۇ (S1E رەسىم، 3- جەدۋەل ۋە S3 فىلىمى).
گالاكتوزا قوزغىلىدىغان ئاجرىلىپ چىقىرىشنى ئىپادىلەيدىغان sec31-1 ھۈجەيرىلىرى، Gas1-GFP (GPI-AP، يېشىل) ۋە Mid2-iRFP (TMP، كۆك) ۋە Sec13-mCherry (ERES، قىزىل رەڭلىك) قاتارلىق تەركىبلىك ERES بەلگىسى 37 گە قويۇلدى. °C دا 30 مىنۇت تۇرغۇزۇلغاندىن كېيىن، ئاجرىلىپ چىقىرىش توسۇقىنى قويۇپ بېرىش ئۈچۈن 24 سېلسىيە گرادۇسقا يۆتكىلىڭ ۋە 20 مىنۇتتىن كېيىن SCLIM ئارقىلىق رەسىمگە تارتىڭ. (A دىن C غىچە) يۈك ۋە ERES بىلەن بەلگىلەنگەن 10 z-قىسىمنىڭ ۋەكىللىك 2D پرويېكسىيە رەسىملىرى (A؛ كۆلەم بالداق، 1μm) ياكى 3D ھۈجەيرە يېرىم شار رەسىملىرى (B ۋە C؛ كۆلەم بىرلىكى، 0.456μm). (B) دىكى ئاستىنقى تاختى ۋە (C) دىكى تاختى پەقەت ERES دىكى (قىزىل رەڭلىك) بۇيۇملارنى كۆرسىتىش ئۈچۈن بىر تەرەپ قىلىنغان رەسىملەرنى كۆرسىتىدۇ [Gas1-GFP (كۈلرەڭ) ۋە Mid2-iRFP (ئاچ كۆك)]. (C) ئوچۇق ئوق: ERES پەقەت بىر پارچە يۈكنى توشۇيدۇ (1 دىن 4 گىچە). كۈلرەڭ ئوق: ERES ئايرىم يۈكنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ (5). ئاق رەڭلىك پۈتۈن ئوق: بىرلىكتە جايلاشقان يۈكنى ئۆز ئىچىگە ئالغان ERES. تۆۋەندە: تاللانغان يەككە ERES پەقەت Gas1-GFP (1) ياكى Mid2-iRFP (2) نى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ. كۆلەم بالداق، 100 نانومېتىر. (D) (C) دە تەسۋىرلەنگەن فوتومىكروگرافىيەنىڭ مىقدارى. پەقەت بىرلا يۈكنى (Gas1-GFP ياكى Mid2-iRFP)، ئايرىم يۈكنى ۋە ئۈستى-ئۈستى يۈكنى ئۆز ئىچىگە ئالغان ERES نىڭ ئوتتۇرىچە نىسبىتى. ئۈچ مۇستەقىل سىناقتا، 54 كاتەكچىدە n=432. خاتالىق بالداق = SD. ئىككى قۇيرۇقلۇق جۈپلەشمىگەن t سىنىقى. *** P = 0.0002. (E) كارانتىن قىلىنغان يۈكنىڭ تاللانغان ERES نىڭ (C) بەلگىسى قويۇلغان 3D رەسىمى. Gas1-GFP (يېشىل) (3) ياكى Mid2-iRFP (كۆك) (4) بىر تەرەپتىن ERES (قىزىل قىزىل) غا كىرىدۇ ۋە ERES ئىچىدىكى كىچىك بىر رايون بىلەنلا چەكلىنىدۇ. بەزىدە، ئىككى خىل يۈك ئوخشاش ERES (5) غا ئوخشاش تەرەپتىن كىرىدۇ ۋە ERES ئىچىدىكى ئايرىم رايون بىلەن چەكلىنىدۇ. كۆلەم بالداق، 100 نانومېتىر.
ئاندىن، بىز ER پەردىسىدە مەۋجۇت بولغان ئۇزۇن ئاتسىل زەنجىرلىك سېرامىد (C26) نىڭ Gas1 نىڭ ئالاھىدە توپلىنىشى ۋە تۈرلىنىشىنى تاللاپ ERES غا ئايلاندۇرىدىغانلىقى توغرىسىدىكى پەرەزنى سىناق قىلدۇق. بۇ مەقسەت ئۈچۈن، بىز ئۆزگەرتىلگەن خېمىر تۈرى GhLag1 نى ئىشلەتتۇق، بۇ تۈردىكى ئىككى ئىچكى سېرامىد سىنتېزاسى Lag1 ۋە Lac1 نىڭ ئورنىنى GhLag1 (پاختانىڭ Lag1 گومولوگى) ئالدى، نەتىجىدە ھۈجەيرە پەردىسىدىكى سېرامىد تۈرى ياۋا تىپتىن قىسقا بولغان خېمىر تۈرى ھاسىل بولدى (3A-رەسىم) (28). ماسسا سپېكترومېتىرىيەسى (MS) ئانالىزى شۇنى كۆرسەتتىكى، ياۋا تىپلاردا، ئومۇمىي سېرامىدنىڭ %95 ى ناھايىتى ئۇزۇن (C26) زەنجىرلىك سېرامىد، GhLag1 دا بولسا، سېرامىدنىڭ %85 ى ناھايىتى ئۇزۇن (C18 ۋە C16). )، سېرامىدنىڭ پەقەت %2 ىلا ناھايىتى ئۇزۇن (C26) زەنجىرلىك سېرامىد. گەرچە ھازىرغىچە GhLag1 پەردىسىدە بايقالغان ئاساسلىق سېرامىدلار C18 ۋە C16 سېرامىدلىرى بولسىمۇ، MS ئانالىزى يەنە GhLag1 تۈرىدە ئىپادىلەنگەن Gas1-GFP نىڭ GPI لەڭگىرىنىڭ C26 سېرامىدنى ئۆز ئىچىگە ئالىدىغانلىقىنى جەزملەشتۈردى، بۇ ياۋا تىپتىكى لىپىدلارغا ئوخشايدۇ. سۈپىتى ئوخشاش (3A-رەسىم) (26). شۇڭا، بۇ سېرامىدنى قايتا قۇرۇش ئېنزىم Cwh43 نىڭ C26 سېرامىدقا نىسبەتەن يۇقىرى تاللاشچانلىقىدىن دېرەك بېرىدۇ، 26-رەسىمدە كۆرسىتىلگەندەك، ئۇ GhLag1 تۈرىدىكى ئاز مىقداردىكى C26 سېرامىدتىن GPI لەڭگىرىنى ئەۋزەل قوبۇل قىلىدۇ. S2 (29). شۇنداقتىمۇ، GhLag1 نىڭ ھۈجەيرە پەردىسىدە ئاساسەن پەقەت C18-C16 سېرامىد بار، Gas1-GFP دا يەنىلا C26 سېرامىد بار. بۇ پاكىت بۇ تۈرنى ER دىكى پەردە سېرامىدنىڭ ئاتسىل زەنجىر ئۇزۇنلۇقى مەسىلىسىنى ھەل قىلىش ئۈچۈن ئەڭ ياخشى قورالغا ئايلاندۇرىدۇ. سىنىپ ۋە تۈرلەشنىڭ پەرەز قىلىنغان رولى. ئاندىن، بىز ئالدى بىلەن C26 Gas1-GFP نىڭ GhLag1 دىكى تېمپېراتۇرىغا سەزگۈر مۇتانت ئاللېلى بىلەن توپلىنىش ئىقتىدارىنى ئەنئەنىۋى فلۇئورېسسېنسىيە مىكروسكوپى ئارقىلىق تەتقىق قىلدۇق، بۇ يەردە پەقەت ئۇزۇن (C18-C16) زەنجىر ER پەردىسى سېرامىدتا مەۋجۇت (3-رەسىم). بىز 31-1-قىسىمدا، Gas1-GFP نىڭ كۆپ قىسمى توپلارغا مەركەزلەشكەنلىكىنى، ئۇزۇن (C18-C16) ئۇزۇن سېرامىد ER پەردىسى بىلەن 31-1-قىسىم GhLag1 دىكى Gas1-GFP نىڭ بولسا ئاساسەن توپلانمىغانلىقىنى ۋە پۈتۈن ER پەردىسىدە تارقالغانلىقىنى كۆزەتتۇق. ئېنىق قىلىپ ئېيتقاندا، C26 سېرامىد ئاساسلىق توپلىنىش مەلۇم ERES بىلەن زىچ مۇناسىۋەتلىك بولغاچقا (1-رەسىم)، بىز ئاندىن بۇ جەرياننىڭ ER ئېكسپورت ئاقسىلى مېخانىزمىنىڭ رولىنىمۇ ئۆز ئىچىگە ئېلىشى مۇمكىن ياكى ئەمەسلىكىنى تەكشۈردۇق. GPI-AP ER ئېكسپورتى ئۈچۈن ئالاھىدە COPII سىستېمىسىنى ئىشلىتىدۇ، بۇ سىستېمىنى Ted1 نىڭ GPI لەڭگىرىنىڭ گلىكان قىسمىنى قۇرۇلما جەھەتتىن قايتا قۇرۇشى ئاكتىپ تەڭشىيدۇ (30، 31). ئاندىن رېكومبىنات GPI-گلىكان ترانسمېمبرانا يۈك قوبۇللىغۇچ p24 بىرىكمىسى تەرىپىدىن تونۇلىدۇ، بۇ ئۆز نۆۋىتىدە ئاساسلىق COPII يۈك باغلاش تارماق بىرلىكى Sec24 نىڭ ئالاھىدە ئىزوفورمىسى بولغان Lst1 نى تاللاپ قوبۇل قىلىدۇ، بۇ GPI-AP غا باي COPII ۋېزىكلىسىنى ھاسىل قىلىدۇ (31-33). شۇڭا، بىز بۇ يەككە ئاقسىللارنىڭ (p24 بىرىكمىسى تەركىبى Emp24، GPI-گلىكان قايتا قۇرۇش ئېنزىم Ted1 ۋە ئالاھىدە COPII تارماق بىرلىكى Lst1) ئۆچۈرۈلۈشىنى sec31-1 مۇتانت تىپى بىلەن بىرلەشتۈرگەن قوش مۇتانتنى قۇردۇق ۋە ئۇلارنى تەتقىق قىلدۇق. Gas1 توپى GFP نى ھاسىل قىلىش مۇمكىنمۇ؟ (3-رەسىم). بىز sec31-1emp24Δ ۋە sec31-1ted1Δ دا، Gas1-GFP نىڭ ئاساسلىقى توپلانمىغان ۋە ER پەردىسىگە تارقالغانلىقىنى، ئىلگىرى sec31-1 GhLag1 دا كۆرۈلگەندەك، sec31-1lst1Δ دا بولسا، Gas1-GFP نىڭ sec31-1 گە ئوخشاش ئىكەنلىكىنى كۆزەتتۇق. بۇ نەتىجىلەر ER پەردىسىدە C26 سېرامىدنىڭ مەۋجۇتلۇقىدىن باشقا، Gas1-GFP نىڭ توپلىنىشىنىڭ p24 بىرىكمىسىگە باغلىنىشى كېرەكلىكىنى ۋە ئالاھىدە Lst1 قوبۇل قىلىشنى تەلەپ قىلمايدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. ئاندىن، بىز ER پەردىسىدىكى سېرامىدنىڭ زەنجىر ئۇزۇنلۇقىنىڭ Gas1-GFP نىڭ p24 گە باغلىنىشىنى تەڭشىيەلەيدىغانلىقىنى تەكشۈردۇق. قانداقلا بولمىسۇن، بىز پەردىدە C18-C16 سېرامىدنىڭ مەۋجۇتلۇقىنىڭ p24 بىرىكمىسى تەرىپىدىن قايتا قۇرۇلغان GPI-گلىكانلارغا (S3 ۋە S4، A ۋە B رەسىملىرى) ياكى GPI-AP غا باغلىنىپ، GPI-AP نى ئېكسپورت قىلىش ئىقتىدارىغا تەسىر كۆرسەتمەيدىغانلىقىنى بايقىدۇق. COPII تارماق تىپى Lst1 نى قوبۇل قىلىڭ (S4C-رەسىم). شۇڭا، C26 سېرامىدقا تايىنىدىغان توپلىنىش ئاقسىلنىڭ ھەر خىل ER ئېكسپورت ئاقسىل مېخانىزمى بىلەن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىشىنى تەلەپ قىلمايدۇ، بەلكى لىپىد ئۇزۇنلۇقى بىلەن ھەرىكەتلەندۈرۈلىدىغان باشقا تۈرگە ئايرىش مېخانىزمىنى قوللايدۇ. ئاندىن، بىز ER پەردىسىدىكى سېرامىد ئاتسىل زەنجىرى ئۇزۇنلۇقىنىڭ Gas1-GFP نى تاللاشچان ERES دەپ ئۈنۈملۈك تۈرگە ئايرىش ئۈچۈن مۇھىم ياكى ئەمەسلىكىنى تەھلىل قىلدۇق. قىسقا زەنجىرلىك سېرامىد بىلەن GhLag1 تۈرىدىكى Gas1 ER دىن ئايرىلىپ، پلازما پەردىسىگە كىرىدىغان بولغاچقا (S5-رەسىم)، ئەگەر تۈرگە ئايرىش سېرامىد ئاتسىل زەنجىرىنىڭ ئۇزۇنلۇقى بىلەن ھەرىكەتلەندۈرۈلسە، GhLag1 تۈرىدىكى Gas1 نى قايتا يۆنىلىشكە يۆتكىگىلى ۋە كېسىشتۈرگىلى بولىدۇ دەپ قارايمىز. ئوخشاش پەردە بىلەن ERES تاۋارلىرى.
(A) GhLag1 نىڭ ھۈجەيرە پەردىسى ئاساسلىقى قىسقا C18-C16 سېرامىدلىرىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ، Gas1-GFP نىڭ GPI لەڭگىرى يەنىلا ياۋا تىپتىكى ھۈجەيرىلەر بىلەن ئوخشاش C26 IPC غا ئىگە. ئۈستىدىكى رەسىم: ماسسا سپېكترومېتىرىيەسى (MS) ئارقىلىق ياۋا تىپتىكى (Wt) ۋە GhLag1p تۈرلىرىنىڭ ھۈجەيرە پەردىسىدىكى سېرامىدنىڭ ئاتسىل زەنجىر ئۇزۇنلۇقى ئانالىزى. سانلىق مەلۇماتلار ئومۇمىي سېرامىدنىڭ نىسبىتىنى كۆرسىتىدۇ. ئۈچ مۇستەقىل سىناقنىڭ ئوتتۇرىچە قىممىتى. خاتالىق بالداق = SD. ئىككى قۇيرۇقلۇق جۈپلەشمىگەن t سىنىقى. **** P <0.0001. ئاستىنقى تاختى: ياۋا تىپتىكى ۋە GhLag1p تۈرلىرىدە ئىپادىلەنگەن Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI لەڭگىرىدىكى IPC نىڭ ئاتسىل زەنجىر ئۇزۇنلۇقىنىڭ MS ئانالىزى. سانلىق مەلۇماتلار ئومۇمىي IPC سىگنالىنىڭ نىسبىتىنى كۆرسىتىدۇ. بەش مۇستەقىل سىناقنىڭ ئوتتۇرىچە قىممىتى. خاتالىق بالداق = SD. ئىككى قۇيرۇقلۇق جۈپلەشمىگەن t سىنىقى. ns، مۇھىم ئەمەس. P = 0.9134. (B) گالاكتوزا قوزغىغان Gas1-GFP نى ئىپادىلەيدىغان sec31-1، sec31-1 GhLag1، sec31-1emp24Δ، sec31-1ted1Δ ۋە sec31-1lst1Δ ھۈجەيرىلىرىنىڭ فلۇئورېسسېنسىيە مىكروسكوپلىرى 37 سېلسىيە گرادۇستا 30 مىنۇت ئىنكۇباتسىيە قىلىندى ۋە 24 سېلسىيە گرادۇستىن كېيىن دائىملىق فلۇئورېسسېنسىيە مىكروسكوپىيەسى ئېلىپ بېرىلدى. ئاق كۆرسەتكۈچ: ER Gas1-GFP توپى. ئوچۇق كۆرسەتكۈچ: توپلانمىغان Gas1-GFP پۈتۈن ER پەردىسىگە تارقالغان بولۇپ، ER نىڭ خاس يادرو ھالقىسى رەڭگىنى كۆرسىتىدۇ. كۆلەم بالداق، 5μm. (C) (B) دا تەسۋىرلەنگەن فوتومىكروسكوپنىڭ مىقدارلاشتۇرۇلۇشى. نۇقتالىق Gas1-GFP قۇرۇلمىسىغا ئىگە ھۈجەيرىلەرنىڭ ئوتتۇرىچە نىسبىتى. ئۈچ مۇستەقىل سىناقتا، n≥300 ھۈجەيرە. خاتالىق بالداق = SD. ئىككى قۇيرۇقلۇق جۈپلەشمىگەن t سىنىقى. **** P <0.0001.
بۇ مەسىلىنى بىۋاسىتە ھەل قىلىش ئۈچۈن، بىز GhLag1 دىكى Gas1-GFP ۋە Mid2-iRFP نى sec31-1 تېمپېراتۇرىغا سەزگۈر مۇتانت ئاللېل بىلەن SCLIM كۆرۈنۈشلۈكىنى ئېلىپ باردۇق (4-رەسىم ۋە S4 فىلىمى). ER 37 سېلسىيە گرادۇستا ساقلىنىپ، كېيىن 24 سېلسىيە گرادۇستا قويۇپ بېرىلگەندىن كېيىن، يېڭىدىن سىنتېزلانغان Gas1-GFP نىڭ كۆپ قىسمى ئادەتتىكى مىكروسكوپلار تەرىپىدىن كۆزىتىلگەندەك ER پەردىسىگە توپلىنىپ تارقالمىدى (4-رەسىم، A ۋە B). بۇنىڭدىن باشقا، ERES نىڭ كۆپ قىسمى (67%) ئۇنىڭدا بىللە جايلاشقان ئىككى خىل يۈكنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ (4D-رەسىم). 4C رەسىمنىڭ 1- ۋە 2- تاختىلىرىدا Gas1-GFP ۋە Mid2-GFP نىڭ قاپلىشىپ كەتكەن ئىككى تىپىك ERES مىسالى كۆرسىتىلدى. بۇنىڭدىن باشقا، ھەر ئىككى تاۋار ئوخشاش ERES غا توپلاندى (4E-رەسىم، 3- تاختا ۋە S4 فىلىمى). شۇڭا، بىزنىڭ نەتىجىلىرىمىز ER پەردىسىدىكى سېرامىد ئاتسىل زەنجىرىنىڭ ئۇزۇنلۇقى ER ئاقسىلىنىڭ يىغىلىشى ۋە تۈرگە ئايرىلىشىنىڭ مۇھىم بەلگىلىگۈچىسى ئىكەنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
Sec31-1 گالاكتوزا قوزغىغان ئاجرىلىپ چىقىرىش ماددىلارنى ئىپادىلەيدىغان GhLag1 ھۈجەيرىلىرى، Gas1-GFP (GPI-AP، يېشىل) ۋە Mid2-iRFP (TMP، كۆك) ۋە ERES بەلگىسى قويۇلغان Sec13-mCherry (ERES، قىزىل رەڭلىك) 37 سېلسىيە گرادۇستا ئىنكۇباتسىيە قىلىڭ. 30 مىنۇت داۋاملاشتۇرۇڭ، ئاجرىلىپ چىقىرىش ئۈچۈن 24 سېلسىيە گرادۇسقا چۈشۈرۈڭ ۋە 20 مىنۇتتىن كېيىن SCLIM ئارقىلىق سۈرەتكە تارتىڭ. (A دىن C غىچە) يۈك ۋە ERES بىلەن بەلگىلەنگەن 10 z-قىسىمنىڭ ۋەكىللىك 2D پرويېكسىيە سۈرەتلىرى (A؛ كۆلەم بالداق، 1μm) ياكى 3D ھۈجەيرە يېرىم شار سۈرەتلىرى (B ۋە C؛ كۆلەم بىرلىكى، 0.45μm). (B) دىكى ئاستىنقى تاختى ۋە (C) دىكى تاختىدا پەقەت ERES دىكى (قىزىل رەڭلىك) تاۋارلارنى كۆرسىتىش ئۈچۈن بىر تەرەپ قىلىنغان سۈرەتلەر كۆرسىتىلىدۇ [Gas1-GFP (كۈلرەڭ) ۋە Mid2-iRFP (ئاچ كۆك)]. (C) ئاق تولدۇرۇلغان ئوق: ERES، تاۋارلار قاپلىنىدۇ. ئاچقۇچ ئوق: ERES پەقەت بىرلا بۇيۇمنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ. ئاستىنقى تاختى: تاللانغان ERES دا (C) بەلگىسى قويۇلغان ئۈستى-ئۈستىگە چاپلانغان ماللار (1 ۋە 2) بار. كۆلەم بالداق، 100 نانومېتىر. (D) (C) بەلگىسى قويۇلغان فوتومىكروگرافىيەنىڭ مىقدارى. 31-1-قىسىم ۋە 31-1-قىسىم GhLag1 بىرلىكلىرىدە، پەقەت بىرلا يۈك (Gas1-GFP ياكى Mid2-iRFP) كىرگۈزۈلگەن، ھەمدە ئايرىم يۈك ۋە ئۈستى-ئۈستىگە چاپلانغان يۈكلەر ئۈچۈن ERES نىڭ ئوتتۇرىچە نىسبىتى كۆرسىتىلگەن. ئۈچ مۇستەقىل سىناقتا، 54 كاتەكچىدە n = 432 (31-1-قىسىم) ۋە 47 كاتەكچىدە n = 430 (31-1-قىسىم GhLag1). خاتالىق بالداق = SD. ئىككى قۇيرۇقلۇق جۈپلەشمىگەن t سىنىقى. *** P = 0.0002 (31-1-قىسىم) ۋە ** P = 0.0031 (31-1-قىسىم GhLag1). (E) (C) بەلگىسى قويۇلغان ئۈستى-ئۈستىگە چاپلانغان يۈك (3) بىلەن تاللانغان ERES نىڭ 3D رەسىمى. Gas1-GFP (يېشىل) ۋە Mid2-iRFP (كۆك) ERES (قىزىل قىزىل) غا ئوخشاش تەرەپتىن يېقىنلىشىدۇ ۋە ئوخشاش ERES چەكلەنگەن رايوندا تۇرىدۇ. ماسلىشىش بالداق، 100 نانومېتىر.
بۇ تەتقىقات ماي ئاساسلىق ئاقسىل يۈكلىرىنىڭ ئاجرىتىش يولىدا تاللاش خاراكتېرلىك ئېكسپورت ئورۇنلىرىغا ئايرىلىدىغانلىقىنىڭ بىۋاسىتە تىرىك جانلىق دەلىلىنى تەمىنلەيدۇ، ھەمدە تۈرگە ئايرىش تاللاشچانلىقى ئۈچۈن ئاتسىل زەنجىرى ئۇزۇنلۇقىنىڭ مۇھىملىقىنى ئاشكارىلايدۇ. SCLIM دەپ ئاتىلىدىغان كۈچلۈك ۋە ئەڭ ئىلغار مىكروسكوپ تېخنىكىسىنى ئىشلىتىپ، بىز خېمىردىكى يېڭى بىرىكتۈرۈلگەن Gas1-GFP (ئېغىر ئاتسىل زەنجىرى (C26) سېرامىد ماي قىسمىغا ئىگە ئاساسلىق پلازما پەردىسى GPI-AP) نى كۆرسەتتۇق. ئايرىم ER لارغا توپلانغان رايونلار ئالاھىدە ERES بىلەن مۇناسىۋەتلىك، ترانسمېبرانا ئاجرىتىلغان ئاقسىللار بولسا ER پەردىسىگە تارقالغان (1-رەسىم). بۇنىڭدىن باشقا، بۇ ئىككى خىل تاۋار تاللاش خاراكتېرلىك ئوخشىمىغان ERES غا كىرىدۇ (2-رەسىم). پەردىدىكى ھۈجەيرە سېرامىدنىڭ ئاتسىل زەنجىرى ئۇزۇنلۇقى C26 دىن C18-C16 غا قىسقىرايدۇ، Gas1-GFP توپى ئايرىم ER رايونىغا پارچىلىنىدۇ، ھەمدە Gas1-GFP ئوخشاش ERES ئارقىلىق ترانسمېبرانا ئاقسىلى بىلەن ER دىن ئايرىلىش ئۈچۈن قايتا يولغا قويۇلىدۇ (3-رەسىم ۋە 3-رەسىم). 4).
گەرچە GPI-AP ER دىن چىقىش ئۈچۈن ئالاھىدە ئاقسىل مېخانىزمىنى ئىشلەتسىمۇ، بىز C26 سېرامىدقا تايىنىدىغان ئايرىلىشنىڭ ERES نىڭ ئالاھىدەلىشىشىغا ئېلىپ كېلىدىغان پەرقلىق ئاقسىل ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىشىگە تايانمايدىغانلىقىنى بايقىدۇق (S4 ۋە S5-رەسىملەر). ئەكسىچە، بىزنىڭ بايقاشلىرىمىز لىپىد ئاساسلىق ئاقسىل توپلىنىشى ۋە كېيىن باشقا يۈكلەرنى چىقىرىۋېتىش ئارقىلىق ھەرىكەتلەندۈرۈلىدىغان باشقا تۈرگە ئايرىش مېخانىزمىنى قوللايدۇ. بىزنىڭ كۆزىتىشلىرىمىز مەلۇم بىر ERES بىلەن مۇناسىۋەتلىك Gas1-GFP رايونى ياكى توپىدا پەردە ئارقىلىق ئاجرىتىلغان Mid2-iRFP ئاقسىلى يوقلۇقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ، بۇ C26 سېرامىدقا تايىنىدىغان GPI-AP توپىنىڭ ئۇلارنىڭ ئالاقىدار ERES غا كىرىشىنى ئاسانلاشتۇرىدىغانلىقىنى، شۇنىڭ بىلەن بىر ۋاقىتتا، پەردە ئارقىلىق ئاجرىتىلغان ماددىلارنىڭ بۇ ئالاھىدە ERES غا كىرىشىنى چىقىرىۋېتىدىغانلىقىنى كۆرسىتىدۇ (1- ۋە 2-رەسىملەر). ئەكسىچە، ER پەردىسىدە C18-C16 سېرامىدلىرىنىڭ بولۇشى GPI-AP نىڭ رايون ياكى توپ ھاسىل قىلىشىغا سەۋەب بولمايدۇ، شۇڭا ئۇلار پەردە ئارقىلىق ئاجرىتىلغان ئاقسىللارنى ئوخشاش ERES غا چىقىرىۋەتمەيدۇ ياكى ئالماشتۇرمايدۇ (3- ۋە 4-رەسىملەر). شۇڭا، بىز C26 سېرامىدنىڭ مەلۇم ERES بىلەن مۇناسىۋەتلىك ئاقسىللارنىڭ توپلىنىشىنى ئاسانلاشتۇرۇش ئارقىلىق ئايرىش ۋە تۈرگە ئايرىشنى ئىلگىرى سۈرىدىغانلىقىنى ئوتتۇرىغا قويدۇق.
بۇ C26 سېرامىدقا تايىنىدىغان توپلىنىشنى مەلۇم بىر ER رايونىغا قانداق قىلىپ ئېرىشكىلى بولىدۇ؟ پەردە سېرامىدنىڭ يان تەرەپكە ئايرىلىش خاھىشى GPI-AP ۋە C26 سېرامىدنىڭ قىسقا ۋە تويۇنمىغان گلىتسېرولىپىدلارنى ئۆز ئىچىگە ئالغان ER پەردىسىنىڭ تېخىمۇ قالايمىقان لىپىد مۇھىتىدا كىچىك ۋە دەرھال تەرتىپلىك لىپىدلارنى ھاسىل قىلىشىغا سەۋەب بولۇشى مۇمكىن. سۈپەتلىك توپلار (17، 18). بۇ كىچىك ۋاقىتلىق توپلار p24 مۇرەككەپ توپىغا باغلانغاندىن كېيىن تېخىمۇ چوڭ، تېخىمۇ مۇقىم توپلارغا قوشۇلىدۇ (34). بۇنىڭغا ئاساسەن، بىز C26 Gas1-GFP نىڭ تېخىمۇ چوڭ كۆرۈنىدىغان توپلارنى ھاسىل قىلىش ئۈچۈن p24 مۇرەككەپ توپى بىلەن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىشى كېرەكلىكىنى كۆرسەتتىك (3-رەسىم). p24 مۇرەككەپ توپى خېمىردىكى تۆت خىل p24 ترانسمېبران ئاقسىلىدىن تەركىب تاپقان ھېتېروزىگوت ئولىگومېر (35) بولۇپ، ئۇ كۆپ ۋالېنتلىق باغلىنىشنى تەمىنلەيدۇ، بۇ كىچىك GPI-AP توپلىرىنىڭ كېسىشمە باغلىنىشىغا ئېلىپ كېلىدۇ، شۇنىڭ بىلەن تېخىمۇ چوڭ مۇقىم توپ ھاسىل قىلىدۇ (34). GPI-AP لارنىڭ ئاقسىل ئېكتودومېنلىرى ئوتتۇرىسىدىكى ئۆز-ئارا تەسىر ئۇلارنىڭ توپلىنىشىغا تۆھپە قوشۇشى مۇمكىن، بۇ سۈت ئەمگۈچىلەرنىڭ قۇتۇپلاشقان ئېپىتېلىي ھۈجەيرىلىرىدە گولگى توشۇش جەريانىدا كۆرۈلىدۇ (36). قانداقلا بولمىسۇن، ER پەردىسىدە C18-C16 سېرامىد بولغاندا، p24 بىرىكمىسى Gas1-GFP غا باغلانغاندا، چوڭ ئايرىم توپلار شەكىللەنمەيدۇ. ئاساسىي مېخانىزم ئۇزۇن ئاتسىل زەنجىرى سېرامىدنىڭ ئالاھىدە فىزىكىلىق ۋە خىمىيىلىك خۇسۇسىيىتىگە باغلىق بولۇشى مۇمكىن. سۈنئىي پەردىلەرنىڭ بىئوفىزىكىلىق تەتقىقاتى شۇنى كۆرسىتىپ بېرىدۇكى، ئۇزۇن (C24) ۋە قىسقا (C18-C16) ئاتسىل زەنجىرى سېرامىدلىرىنىڭ ھەر ئىككىسى باسقۇچنىڭ ئايرىلىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىشى مۇمكىن، ئەمما پەقەت ئۇزۇن ئاتسىل زەنجىرى سېرامىدلىرى (C24)لا يۇقىرى ئەگرىلىك ۋە پەردە ئېگىلىشىنى ئىلگىرى سۈرۈپ، پەردىنىڭ شەكلىنى ئۆزگەرتەلەيدۇ. ئۆز-ئارا پايدىلىنىش ئارقىلىق (17، 37، 38). Emp24 نىڭ ئىنسان گومولوگى بولغان TMED2 نىڭ پەردە سىپرالىنىڭ سىتوپلازما پارچىلىرىدا C18 سېرامىد ئاساسلىق سىفىڭمومىلېن بىلەن تاللاپ ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىدىغانلىقى كۆرسىتىلدى (39). مولېكۇلا دىنامىكىسى (MD) سىمۇلياتسىيەسىنى ئىشلىتىپ، بىز C18 ۋە C26 سېرامىدلىرىنىڭ Emp24 پەردە سىپرالىنىڭ سىتوپلازما پارچىلىرى ئەتراپىدا توپلىنىدىغانلىقىنى ۋە ئۇلارنىڭ ئوخشاش ئەۋزەللىكلەرگە ئىگە ئىكەنلىكىنى بايقىدۇق (S6-رەسىم). بۇنىڭ Emp24 نىڭ پەردە سىپرالىنىڭ پەردىدىكى مايلارنىڭ ئاسسىمېترىك تارقىلىشىغا سەۋەب بولىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدىغانلىقىنى ئەسكەرتىشكە ئەرزىيدۇ. بۇ سۈت ئەمگۈچىلەر ھۈجەيرىلىرىگە ئاساسلانغان يېقىنقى نەتىجە. ئوخشاش MD سىمۇلياتسىيەلىرى يەنە ئېفىر مايلىرىنىڭ بارلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ (40). شۇڭا، بىز ER26 نىڭ ئىككى پارچىسىدىكى C26 سېرامىدنىڭ يەرلىكتە مول ئىكەنلىكىنى پەرەز قىلىمىز. لۇمىنال لوبۇلالىرىدىكى GPI-AP بىۋاسىتە كۆپ ۋالېنتلىق p24 بىلەن باغلىنىپ، سىتوپلازما لوبۇلالىرىدىكى p24 ئەتراپىدا C26 سېرامىدنىڭ توپلىنىشىنى ئىلگىرى سۈرىدۇ (41)، بۇ ئۇنىڭغا ئەگىشىپ كېلىدىغان ئاقسىلنىڭ يىغىلىشىنى ئىلگىرى سۈرىدۇ ۋە پەردە ئەگرىلىكى بارماقلار ئارقىلىق پەيدا بولىدۇ (41)، بۇ GPI-AP نىڭ ERES غا يېقىن ئايرىم رايونلارغا ئايرىلىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ، بۇ يەنە ER پەردىسىنىڭ يۇقىرى ئەگرى رايونلىرىنى قوللايدۇ (42). ئىلگىرىكى دوكلاتلار تەكلىپ قىلىنغان مېخانىزمنى قوللىغان (43، 44). ئولىگولېكتىنلار، كېسەللىك قوزغاتقۇچىلار ياكى ئانتىتېلالارنىڭ سېرامىد ئاساسلىق گلىكوسفىنگولىپىدلارغا (GSL) پلازما پەردىسىدە كۆپ ۋالېنتلىق باغلىنىشى چوڭ GSL يىغىلىشىنى قوزغىتىدۇ، باسقۇچلۇق ئايرىلىشنى كۈچەيتىدۇ ۋە پەردە شەكلىنىڭ ئۆزگىرىشى ۋە ئىچكىلىنىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ (44). ئىۋابۇچى قاتارلىقلار (43) ئۇزۇن (C24)، ئەمما قىسقا (C16) بولمىغان ئاتسىل زەنجىرلىرى مەۋجۇت بولغاندا، GSL لاكتوسىلسېرامىدقا باغلانغان كۆپ ۋالېنتلىق بىرىكمە چوڭ توپلارنىڭ شەكىللىنىشى ۋە پەردىنىڭ ئىنۋاگىناتسىيەسىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغانلىقى، سىتوپلازما لىننىڭ ۋاسىتىلىك سىگنال ئۆتكۈزۈشى قاپاقچىلاردا ئاتسىل زەنجىرلىرى بىلەن باغلىنىپ نېيتروفىللاردا ئۆز-ئارا باغلىنىدىغانلىقى بايقالغان.
سۈت ئەمگۈچىلەرنىڭ قۇتۇپلاشقان ئېپىتېلىي ھۈجەيرىلىرىدە، گولگىغا قارشى تور (TGN) نىڭ ئۇچىي پلازما پەردىسى سەۋىيەسىگىچە بولغان قويۇقلۇقى GPI-AP نىڭ ئايرىلىشى ۋە تۈرگە ئايرىلىشىنى كونترول قىلىدۇ (10، 45). بۇ توپلىنىش GPI-AP ئولىگومېرلىشىشى تەرىپىدىن قوزغىتىلىدۇ (36)، ئەمما ئۇ يەنە خېمىردىكى سېرامىد زەنجىرىنىڭ ئۇزۇنلۇقىغا باغلىق بولۇشى مۇمكىن. سۈت ئەمگۈچىلەرنىڭ GPI-AP نىڭ ئېفىر لىپىد ئاساسلىق لەڭگىرى بار بولۇپ، خىمىيىلىك قۇرۇلمىسى ئىنتايىن ئۇزۇن ئاتسىل زەنجىر سېرامىدتىن پەرقلىق بولسىمۇ، يېقىنقى بىر تەتقىقاتتا ھەر ئىككى لىپىدنىڭ تەدرىجىي تەرەققىيات جەھەتتىن ئوخشاش فىزىكىلىق ۋە خىمىيىلىك خۇسۇسىيەت ۋە ئىقتىدارغا ئىگە ئىكەنلىكى بايقالغان (40). شۇڭا، سۈت ئەمگۈچىلەر ھۈجەيرىلىرىدىكى ئېفىر لىپىد قىسمى خېمىردىكى C26 سېرامىدقا ئوخشاش بولۇشى مۇمكىن، ئۇنىڭ رولى پەردىدىكى ئۇزۇن زەنجىر سېرامىد بىلەن باغلىنىپ، GPI-AP توپلىنىشى ۋە تۈرگە ئايرىلىشىنى ئىلگىرى سۈرۈشتىن ئىبارەت. بۇ ئېھتىماللىقنى بىۋاسىتە سىناق قىلىشقا توغرا كەلسىمۇ، ئىلگىرىكى بايقاشلار ئۇزۇن ئاتسىل زەنجىرلىك سېرامىدنىڭ گولگى تېنىگە توشۇلىشىنىڭ سىتوپلازما يۆتكىلىش ئاقسىلى ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلمايدىغانلىقىنى، بەلكى خېمىرغا ئوخشاش GPI لەڭگەرلىرىنىڭ سىنتېزىغا باغلىق ئىكەنلىكىنى قوللايدۇ. شۇڭلاشقا، تەرەققىياتنىڭ كونسېرۋاتىپ مېخانىزمى ناھايىتى ئۇزۇن ئاتسىل زەنجىرلىك سېرامىد ۋە GPI-AP (13، 16، 20، 46، 47) نى ئوخشاش توشۇش خالتىسىدا تاللاپ بىرلىكتە توشۇيالايدىغاندەك قىلىدۇ.
خېمىر ۋە سۈت ئەمگۈچىلەرنىڭ قۇتۇپلاشقان ئېپىتېلىي ھۈجەيرە سىستېمىسىدا، GPI-AP نىڭ توپلىنىشى ۋە باشقا پلازما پەردە ئاقسىللىرىدىن ئايرىلىشى ھۈجەيرە يۈزىگە يېتىشتىن بۇرۇن يۈز بېرىدۇ. پالادىنو قاتارلىقلار (48) سۈت ئەمگۈچىلەرنىڭ قۇتۇپلاشقان ئېپىتېلىي ھۈجەيرىلىرىنىڭ TGN دا، GPI-AP توپلىنىشى پەقەت GPI-AP نىڭ ئۇچلۇق پلازما پەردىسىگە تاللاپ تۈرگە ئايرىلىشى ئۈچۈنلا ئەمەس، بەلكى GPI-AP نىڭ توپلىنىش تەشكىللىنىشى ۋە ئۇنىڭ بىئولوگىيىلىك پائالىيىتىنىمۇ تەڭشەيدىغانلىقىنى بايقىدى. ھۈجەيرە يۈزى. خېمىردا، بۇ تەتقىقات ER دىكى C26 سېرامىدقا تايىنىدىغان GPI-AP توپلىنىشىنىڭ پلازما پەردىسىدىكى GPI-AP نىڭ توپلىنىش تەشكىللىنىشى ۋە فۇنكسىيەلىك پائالىيىتىنى تەڭشەيدىغانلىقىنى كۆرسەتتى (24، 49). بۇ مودېلغا ماس ھالدا، GhLag1 ھۈجەيرىلىرى GPI چەكلىگۈچىلىرىگە ياكى ھۈجەيرە تام پۈتۈنلۈكىگە تەسىر كۆرسىتىدىغان دورىلارغا ئاللېرگىيىسى بار (28)، خېمىر ھۈجەيرىلىرىنىڭ جۈپلىشىشىدە كۆرسىتىلگەن ئۇچلۇق سېرامىدنىڭ فۇنكسىيەلىك Gas1-GFP توپلىرىغا بولغان ئېھتىياج (49) G نى كۆرسىتىدۇ. hLag1 ھۈجەيرىلىرىنىڭ فىزىئولوگىيىلىك ئاقىۋەتلىرىنىڭ مۇمكىنچىلىكى. GPI-AP خاتالىقى. قانداقلا بولمىسۇن، ھۈجەيرە يۈزىنىڭ فۇنكسىيەلىك تەشكىللىنىشىنىڭ ER دىن ماي ئۇزۇنلۇقىغا ئاساسەن تۈرگە ئايرىش ئۇسۇلى ئارقىلىق پروگراممىلانغان-پروگراممالانمىغانلىقىنى تېخىمۇ چوڭقۇر تەكشۈرۈش كەلگۈسىدىكى تەتقىقاتىمىزنىڭ تېمىسى بولىدۇ.
بۇ ئەسەردە ئىشلىتىلگەن Saccharomyces cerevisiae تۈرلىرى S1 جەدۋەلدە كۆرسىتىلدى. تىرىك ھۈجەيرە رەسىمگە ئېلىش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدىغان SCLIM نىڭ MMY1583 ۋە MMY1635 تۈرلىرى W303 نىڭ ئارقا كۆرۈنۈشىدە ياسالغان. Sec13-mCherry نى فلۇئورېسسېنتلىق ئاقسىل بەلگىسى بىلەن ئىپادىلەيدىغان بۇ تۈرلەر پولىمېراز زەنجىرسىمان رېئاكسىيە (PCR) ئاساسلىق ئۇسۇل ئارقىلىق pFA6a پلازمىدى قېلىپ سۈپىتىدە ئىشلىتىلگەن (23). GAL1 پروموتېرىنىڭ كونتروللۇقى ئاستىدا فلۇئورېسسېنتلىق ئاقسىل بىلەن بەلگە قويۇلغان Mid2-iRFP نى ئىپادىلەيدىغان تۈر تۆۋەندىكىدەك ياسالغان. pKTiRFP-KAN ۋېكتورىدىن iRFP-KanMx تىزىملىكىنىڭ PCR كۈچەيتىلىشى (E. O'Shea نىڭ سوۋغىسى، Addgene پلازمىد نومۇرى 64687؛ http://n2t.net/addgene: 64687؛ تەتقىقات مەنبەسى ئېنىقلىغۇچ (RRID): Addgene_64687) ۋە ئىچكى Mid2 نىڭ C ئۇچىغا كىرگۈزۈلگەن. Mid2-iRFP گېنوم تەرتىپى كۈچەيتىلىپ، GAL1 پروموتېرىغا كىلونلانغاندىن كېيىن، ئۇ pRS306 بىرىكتۈرۈش پلازمىدىنىڭ Not I-Sac I ئورنىغا بىرىكتۈرۈلدى. نەتىجىدە ھاسىل بولغان pRGS7 پلازمىدى URA3 ئورنىغا بىرىكتۈرۈش ئۈچۈن Pst I بىلەن سىزىقلاشتۇرۇلدى.
Gas1-GFP بىرىكمە گېنى GAL1 ئىلگىرى سۈرگۈچىسىنىڭ كونتروللۇقى ئاستىدا سېنترومېر (CEN) پلازمىسىدا ئىپادىلىنىدۇ، بۇ پلازمىسى تۆۋەندىكىدەك قۇرۇلىدۇ. Gas1-GFP تەرتىپى pRS416-GAS1-GFP پلازمىسىدىن (24) (L. Popolo نىڭ سوۋغىسى) PCR ئارقىلىق كۈچەيتىلىپ، CEN پلازمىسى pBEVY-GL LEU2 (C نىڭ سوۋغىسى) نىڭ Xma I–Xho I ئورنىغا كىلونلاندى. Miller؛ Addgene پلازمىسى نومۇرى 51225؛ http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). نەتىجىدە ھاسىل بولغان پلازمىدا pRGS6 دەپ ئاتىلىدۇ. Axl2-GFP بىرىكمە گېنىمۇ pBEVY-GL LEU2 ۋېكتورىنىڭ GAL1 ئىلگىرى سۈرگۈچىسىنىڭ كونتروللۇقى ئاستىدا ئىپادىلىنىدۇ، ئۇنىڭ قۇرۇلمىسى تۆۋەندىكىدەك. Axl2-GFP تىزىملىكى pRS304-p2HSE-Axl2-GFP پلازمىدىدىن (23) PCR ئارقىلىق كۈچەيتىلدى ۋە pBEVY-GL LEU2 ۋېكتورىنىڭ Bam HI-Pst I ئورنىغا كىلونلاندى. نەتىجىدە ھاسىل بولغان پلازمىد pRGS12 دەپ ئاتىلدى. بۇ تەتقىقاتتا ئىشلىتىلگەن ئولىگونۇكلېئوتىدلارنىڭ تىزىملىكى S2 جەدۋەلدە كۆرسىتىلدى.
بۇ تۈرگە %0.2 ئادېنىن ۋە %2 گلۇكوزا [YP-دېكستروز (YPD)]، %2 راففىنوز [YP-راففىنوز] مول ئېچىتقۇ ئېكىستراكتى ئاقسىلى p (YP) ئوتتۇرا قىسمى (%1 ئېچىتقۇ ئېكىستراكتى ۋە %2 ئاقسىل ept). (YPR)] ياكى %2 گالاكتوزا [YP-گالاكتوز (YPG)] كاربون مەنبەسى سۈپىتىدە، ياكى سۈنئىي مىنىمال ئوتتۇرا قىسمى (%0.15 ئېچىتقۇ ئازوت ئاساسى ۋە %0.5 ئاممونىي سۇلفات) ئارقىلىق ئوزۇقلۇق ئۈچۈن زۆرۈر بولغان مۇۋاپىق ئامىنو كىسلاتا ۋە ئاساسلارنى تولۇقلاش ئۈچۈن قوشۇلدى. ھەمدە كاربون مەنبەسى سۈپىتىدە %2 گلۇكوزا (سىنتېز گىلوكوز ئەڭ تۆۋەن ئوتتۇرا قىسمى) ياكى %2 گالاكتوز (سىنتېز گالاكتوز ئەڭ تۆۋەن ئوتتۇرا قىسمى) بار.
ھەقىقىي ۋاقىتلىق سۈرەتكە ئېلىش ئۈچۈن، GAL1 پروموتېرى ئاستىدا قۇرۇلمىنى ئىپادىلەيدىغان تېمپېراتۇرىغا سەزگۈر sec31-1 مۇتانت ھۈجەيرىلىرى 24 سېلسىيە گرادۇسلۇق YPR مۇھىتىدا بىر كېچە ئۆستۈرۈلگەندىن كېيىن، ئوتتۇرا لوگاف باسقۇچىغا كىرگەن. 24 سېلسىيە گرادۇسلۇق YPG دا 1 سائەت ئىندۇكسىيە قىلىنغاندىن كېيىن، ھۈجەيرىلەر 37 سېلسىيە گرادۇسلۇق SG دا 30 مىنۇت ئىنكۇباتسىيە قىلىنغاندىن كېيىن، ئاجرىلىپ چىقىش توسۇقىدىن قۇتۇلۇش ئۈچۈن 24 سېلسىيە گرادۇسلۇق تېمپېراتۇرىغا يۆتكىلىپ، ھۈجەيرىلەرنى ئەينەك سىيرىلما تاختىسىغا چاپلاپ، SCLIM ئارقىلىق سۈرەتكە ئېلىنغان. كونكاناۋالىن A ھۈجەيرىلەرنى ئەينەك سىيرىلما تاختىسىغا چاپلاپ، SCLIM ئارقىلىق سۈرەتكە ئېلىنغان. SCLIM بولسا Olympus IX-71 تەتۈر فلۇئورېسسېنسىيەلىك مىكروسكوپ ۋە UPlanSApo 100×1.4 سانلىق دىئافراگما ماي لىنزىسى (Olympus)، يۇقىرى سۈرئەتلىك ۋە يۇقىرى سىگنال-شاۋقۇن نىسبىتىدىكى ئايلىنىدىغان دىسكا كونفوكال سكاننېرى (Yokogawa Electric)، خاسلاشتۇرۇلغان سپېكترومېتىر ۋە خاسلاشتۇرۇلغان سوۋۇتۇشنىڭ بىرىكمىسى. سىستېمىنىڭ رەسىم كۈچەيتكۈچ (Hamamatsu Photonics) ئاخىرقى چوڭايتىش ×266.7 بولغان چوڭايتىش لىنزا سىستېمىسى ۋە ئېلېكترونلارنى كۆپەيتىدىغان زەرەتلەش ئۇلانغان ئۈسكۈنە كامېراسى (Hamamatsu Photonics) بىلەن تەمىنلىيەلەيدۇ (21). رەسىم ئېلىش خاسلاشتۇرۇلغان يۇمشاق دېتال (Yokogawa Electric) تەرىپىدىن ئېلىپ بېرىلىدۇ. 3D رەسىملەر ئۈچۈن، بىز خاسلاشتۇرۇلغان پىئېزوئېلېكتر ھەرىكەتلەندۈرگۈچنى ئىشلىتىپ ئوبيېكتىپ لىنزىسىنى تىك ھالەتتە تىترەتتۇق ۋە ئوپتىكىلىق قىسىملارنى 100 نانومېتىر ئارىلىقتا بىر قاتلىدۇق. Z قاتلىما رەسىم 3D ۋوكسېل سانلىق مەلۇماتلىرىغا ئايلاندۇرۇلىدۇ، ئايلىنىدىغان دىسكا كونفوكال مىكروسكوپىدا ئىشلىتىلگەن نەزەرىيەۋى نۇقتا تارقىلىش فۇنكسىيەسى Volocity يۇمشاق دېتالى (PerkinElmer) تەرىپىدىن دېكونۋولۇتسىيە بىر تەرەپ قىلىش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدۇ. Volocity يۇمشاق دېتالى ئارقىلىق ئاپتوماتىك ھالدا بىرلىكتە ئورۇن تەھلىل قىلىش چېكىگە يەتكۈزۈلدى، بۇنىڭ بىلەن يۈكنى ئۆز ئىچىگە ئالغان ERES ئۆلچەندى. سىزىق سىكانىرلاش ئانالىزى MetaMorph يۇمشاق دېتالى (Molecular Devices) ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى.
ستاتىستىكىلىق ئەھمىيىتىنى بېكىتىش ئۈچۈن GraphPad Prism يۇمشاق دېتالىنى ئىشلىتىڭ. ئىككى تەرەپلىك ئوقۇغۇچىنىڭ t سىنىقى ۋە ئادەتتىكى بىر تەرەپلىك ئۆزگىرىشچانلىق ئانالىزى (ANOVA) سىنىقى ئۈچۈن، گۇرۇپپىلار ئارىسىدىكى پەرقنىڭ P <0.05 (*) غا زور تەسىرى بار دەپ قارىلىدۇ.
Gas1-GFP نىڭ فلۇئورېسسېنسىيەلىك مىكروسكوپى ئۈچۈن، لوگافزا ھۈجەيرىلىرى YPD دا بىر كېچە ئۆستۈرۈلگەن ۋە مەركەزدىن قاچۇرۇش ئارقىلىق يىغىۋېلىنغان، ئىككى قېتىم فوسفاتلىق تۇز ئېرىتمىسى بىلەن يۇيۇلغان ۋە مۇز ئۈستىدە كەم دېگەندە 15 مىنۇت تۇرغۇزۇلغان، ئاندىن ئىلگىرىكى تەكشۈرۈشتە (24) تەسۋىرلەنگەندەك مىكروسكوپ ئاستىدا داۋاملاشتۇرۇلغان. ئوبيېكتىپ لىنزا، L5 (GFP) فىلتىرى، ھاماماتسۇ كامېراسى ۋە Application Suite X (LAS X) يۇمشاق دېتالى بىلەن تەمىنلەنگەن Leica DMi8 مىكروسكوپى (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) ئېلىش ئۈچۈن ئىشلىتىلگەن.
ئەۋرىشكىلەر SDS ئەۋرىشكىسى بۇفېرى بىلەن 65 سېلسىيە گرادۇستا 10 مىنۇت دېناتۇراتسىيە قىلىندى، ئاندىن SDS-پولىئاكرىلامىد گېلى ئېلېكتروفورېزى (PAGE) ئارقىلىق ئايرىلدى. ئىممۇنىتېت بىتاتسىيەسى ئانالىزى ئۈچۈن، ھەر بىر يولدا 10 μl ئەۋرىشكە قويۇلدى. ئاساسلىق ئانتىتېلا: 1:3000 سۇيۇقلۇقتا قويان پولىكلونال ئانتى-Gas1، 1:500 سۇيۇقلۇقتا قويان پولىكلونال ئانتى-Emp24 ۋە 1:3000 سۇيۇقلۇقتا قويان پولىكلونال ئانتى-GFP (H. Riezman نىڭ سوۋغىسى) ئىشلىتىڭ. چاشقان مونوكلونال ئانتى-Pgk1 ئانتىتېلاسى 1:5000 سۇيۇقلۇقتا ئىشلىتىلدى (J. de la Cruz نىڭ سوۋغىسى). ئىككىنچى دەرىجىلىك ئانتىتېلا: 1:3000 سۇيۇقلۇقتا ئىشلىتىلگەن ئات پېروكسىدازا (HRP) بىلەن بىرلەشتۈرۈلگەن ئۆچكە ئانتى-قويان ئىممۇنىتېت گلوبۇلىن G (IgG) (Pierce). HRP بىلەن بىرلەشتۈرۈلگەن ئۆچكە چاشقانغا قارشى IgG 1:3000 (Pierce) سۇيۇلدۇرۇلغان ھالەتتە ئىشلىتىلدى. ئىممۇنىتېت ئىنكاس رايونى SuperSignal West Pico رېئاگېنتىنىڭ (Thermo Fisher Scientific) خېمىلۇمىنېتسېنسىيە ئۇسۇلى ئارقىلىق كۆزىتىلدى.
(31) دە تەسۋىرلەنگەندەك، موللاشتۇرۇلغان ER قىسمىدا تەبىئىي ئىممۇنىتېت چۆكمىسى تەجرىبىسى ئېلىپ بېرىلدى. قىسقىسى، خېمىر ھۈجەيرىلىرىنى TNE بۇففېرى [50 mM tris-HCl (pH 7.5)، 150 mM NaCl، 5 mM EDTA، 1 mM فېنىل مېتىلسۇلفونىل فلورىد ۋە پروتېئازا چەكلىگۈچى ئارىلاشمىسى) بىلەن 600 nm (OD600) دا 100 ئوپتىكىلىق زىچلىقتا ئىككى قېتىم يۇيۇڭ. ئۇ ئەينەك مارجانلار بىلەن پارچىلاندى، ئاندىن ھۈجەيرە قالدۇقلىرى ۋە ئەينەك مارجانلار مەركەزدىن قاچۇرۇش ئارقىلىق چىقىرىۋېتىلدى. ئاندىن ئۈستۈنكى سۇيۇقلۇق 17000 g دا 4 سېلسىيە گرادۇستا 15 مىنۇت مەركەزدىن قاچۇرۇلدى. پېللە TNE دا قايتا ئېرىتىلدى ۋە رەقەملىك ساپونىن قوشۇلۇپ، ئاخىرقى قويۇقلۇقى %1 بولدى. سۇسپېنزىيە 4 سېلسىيە گرادۇستا 1 سائەت ئايلاندۇرۇلۇپ، ئاندىن ئېرىمەيدىغان تەركىبلەر 13000 g دا 4 سېلسىيە گرادۇستا 60 مىنۇت مەركەزدىن قاچۇرۇش ئارقىلىق چىقىرىۋېتىلدى. Gas1-GFP ئىممۇنىتېت چۆكمىسى ئۈچۈن، ئالدى بىلەن ئەۋرىشكە بوش ئاگاروز مارجانلىرى (ChromoTek) بىلەن 4 سېلسىيە گرادۇستا 1 سائەت ئالدىن ئىنۇباتسىيە قىلىندى، ئاندىن GFP-Trap_A (ChromoTek) بىلەن 4 سېلسىيە گرادۇستا 3 سائەت ئىنۇباتسىيە قىلىندى. ئىممۇنىتېت چۆكمىسىگە ئۇچرىغان مارجانلار 0.2% دىگوكسىگېنىن تەركىبىدىكى TNE بىلەن بەش قېتىم يۇيۇلۇپ، SDS ئەۋرىشكە بۇفېرى بىلەن ئېلۇتىلىپ، SDS-PAGE دا ئايرىلىپ، ئىممۇنىتېت بلوتلاش ئارقىلىق تەھلىل قىلىندى.
(31) دە تەسۋىرلەنگەندەك، بېيىتىلگەن ER قىسمىدا كرېست ئۇلىنىشنى بەلگىلەش ئېلىپ بېرىلدى. قىسقىسى، بېيىتىلگەن ER قىسمى 0.5 mM دىتىئوبىس (سۇكسىنىمىدىل پروپىئونات) بىلەن ئىنۇباتسىيە قىلىندى (پىئېرس، تېرمو فىشېر ئىلمىي، روكفورد، ئىللىنوئىس، ئامېرىكا؛ 20 سېلسىيە گرادۇس، 20 مىنۇت). كرېست ئۇلىنىش رېئاكسىيەسى گلىتسىن قوشۇش ئارقىلىق بېسىلدى (ئاخىرقى قويۇقلۇقى 50 mM، 5 مىنۇت، 20 سېلسىيە گرادۇس).
ئىلگىرى تەسۋىرلەنگەندەك (50)، ياۋا تىپتىكى ۋە GhLag1 تۈرلىرىدىكى سېرامىدنىڭ MS ئانالىزى ئېلىپ بېرىلدى. قىسقىسى، ھۈجەيرىلەر 30 سېلسىيە گرادۇستا YPD دا ئېكسپونېنسىئال باسقۇچقا (3 دىن 4 گىچە OD600 بىرلىك/ml) ئۆستۈرۈلدى، ھەمدە 25×107 ھۈجەيرە يىغىۋېلىندى. ئۇلارنىڭ ماددا ئالمىشىشى ئۈچ خىلور ئاتسېتات كىسلاتاسى بىلەن سۈمۈرۈلىدۇ. ئېكىستراكسىيە ئېرىتكۈچى [ئېتانول، سۇ، ئېفىر، پىرىدىن ۋە 4.2 N ئاممونىي گىدروكسىد (15:15:5:1:0.018 v/v)] ۋە ئىچكى ئۆلچەملىك C17 سېرامىد (860517، Avanti قۇتۇپ لىپىدى) سۈپىتىدىكى 1.2 nmol ئىشلىتىڭ. ئېكىستراكتنىڭ يېنىك ئىشقارلىق گىدرولىزىنى ئېلىپ بېرىش ئۈچۈن مونومېتىلامىن رېئاگېنتى [مېتانول، سۇ، n-بۇتانول ۋە مېتىلامىن ئېرىتمىسى (4:3:1:5 v/v)] ئىشلىتىڭ، ئاندىن سۇغا تويۇنغان n-بۇتانولنى ئىشلىتىپ تۇزسىزلاندۇرۇڭ. ئاخىرىدا، ئېكىستراكت مۇسبەت ھالەتتىكى ئېرىتكۈچىدە [خلوروفورم/مېتانول/سۇ (2:7:1) + 5 mM ئاممونىي ئاتسېتات] قايتا ئېرىتىلىپ، ماسسا سپېكترومېتىرىغا ئوكۇل قىلىندى. سفىنگولىپىد مولېكۇلاسىنى ئېنىقلاش ۋە مىقدارلاشتۇرۇش ئۈچۈن كۆپ رېئاكسىيەلىك كۆزىتىش (MRM) ئېلىپ بېرىلدى. TSQ Vantage ئۈچىنچى دەرىجىلىك تۆت پوللۇق ماسسا سپېكترومېتىرى (Thermo Fisher Scientific) لىپىد ئانالىزى ئۈچۈن روبوت نانو ئېقىم ئىئون مەنبەسى Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) بىلەن تەمىنلەنگەن. سوقۇلۇش ئېنېرگىيەسى ھەر بىر سېرامىد تۈرى ئۈچۈن ئەلالاشتۇرۇلغان. MS سانلىق مەلۇماتلىرى مۇسبەت ھالەتتىكى قولغا كەلتۈرۈلدى. ھەر بىر بىئولوگىيىلىك تەكرارلىنىش ئۈچۈن، لىپىد سىگنالى ئۈچ مۇستەقىل ئۆلچەشنىڭ ئوتتۇرا قىممىتى.
(31) دە تەسۋىرلەنگەندەك، Gas1-GFP نى ئىپادىلەيدىغان ھۈجەيرىلەر (800 × 107) تەبىئىي ئىممۇنىتېت چۆكمىسىگە ئۇچرىدى. تازىلانغان Gas1-GFP SDS-PAGE ئارقىلىق ئايرىلىپ، پولىۋىنىلىدىن فتور (PVDF) پەردىسىگە يۆتكەلدى. ئاقسىل PVDF نى ئامىد قارا رەڭ بىلەن بوياش ئارقىلىق كۆرسىتىلدى. Gas1-GFP بەلبېغى PVDF دىن كېسىۋېتىلىپ، 5 قېتىم مېتانول بىلەن، بىر قېتىم سۇيۇق خروماتوگرافىيە-MS (LC-MS) دەرىجىلىك سۇ بىلەن يۇيۇلدى. پەردە بەلبېغىنى 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0)، بۇفېر ۋە 500μl يېڭى ئېرىتىلگەن 1 M ناترىي نىترىت ئارىلاشمىسى بىلەن 37°C دا 3 سائەت ئىنكۇباتسىيە قىلىش ئارقىلىق، Gas1-GFP دىن ماي قىسمى قويۇپ بېرىلىپ، لىزىتلىنىدۇ. گلۇكوزامىن بىلەن ئىنوزىتول ئارىسىدا ئىنوزىن فوسفات سېرامىد قويۇپ بېرىلىدۇ (51). ئۇنىڭدىن كېيىن، پەردە لېنتىسى LC-MS دەرىجىلىك سۇ بىلەن تۆت قېتىم يۇيۇلۇپ، ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا قۇرۇتۇلدى ۋە ئانالىز قىلىنغۇچە -80 سېلسىيە گرادۇسلۇق ئازوت ئاتموسفېراسىدا ساقلاندى. كونترول قىلىش ئۈچۈن، ھەر بىر سىناق ئۈچۈن PVDF پەردىسىنىڭ بوش ئەۋرىشكىسى ئىشلىتىلدى. ئاندىن Gas1-GFP دىن ئېلىنغان ماي (50) نىڭ تەسۋىرىگە ئاساسەن MS ئارقىلىق ئانالىز قىلىندى. قىسقىسى، GPI مايىد تەركىبىدىكى PVDF لېنتىلىرى 75μl مەنپىي قېلىپ ئېرىتكۈچى [خلوروفورم/مېتانول (1:2) + 5mM ئاممونىي ئاتسېتات] دا قايتا ئېرىتىلدى ۋە ئېلېكترو پۈركۈش ئىئونلاشتۇرۇش (ESI)-MRM/MS ئانالىزىدىن ئۆتتى (TSQ Vantage). بۇ ئەھۋالدا، MS سانلىق مەلۇماتلىرى مەنپىي ئىئون ھالىتىدە ئېلىندى.
ئىلگىرى دېيىلگەندەك، GPI لەڭگىرىنىڭ ماي قىسمى [3H]-ئىنوزىتول بەلگىسى قويۇلغان GPI-AP دىن ئايرىلدى (16). مايلار ئېرىتكۈچ سىستېمىسى (55:45:10 خلوروفورم-مېتانول-0.25% KCl) ئارقىلىق نېپىز قەۋەتلىك خروماتوگرافىيە ئارقىلىق ئايرىلدى ۋە FLA-7000 (Fujifilm) ئارقىلىق كۆرسىتىلدى.
Gas1-GFP (600 × 107) نى ئىپادىلەيدىغان ھۈجەيرىلەر TNE بۇففېرى بىلەن ئىككى قېتىم يۇيۇلۇپ، ئەينەك مارجانلار بىلەن پارچىلىنىپ، ئاندىن ھۈجەيرە قالدۇقلىرى ۋە ئەينەك مارجانلارنى چىقىرىۋېتىش ئۈچۈن مەركەزدىن قاچۇرۇلدى. ئاندىن ئۈستۈنكى سۇيۇقلۇق 17000 g دا 4 سېلسىيە گرادۇستا 1 سائەت مەركەزدىن قاچۇرۇلدى. دانچە TNE دا يۇيۇلۇپ، 0.2% digitalis saponin تەركىبىدىكى 1 U PI-PLC (Invitrogen) بىلەن 37 سېلسىيە گرادۇستا 1 سائەت ئىنتۇباتسىيە قىلىندى. ئېنزىم بىلەن بىر تەرەپ قىلىنغاندىن كېيىن، پەردە 17000 g دا 4 سېلسىيە گرادۇستا 1 سائەت مەركەزدىن قاچۇرۇش ئارقىلىق چىقىرىۋېتىلدى. Gas1-GFP نى ئىممۇنىتېتلىق چۆكتۈرۈش ئۈچۈن، ئۈستۈنكى سۇيۇقلۇق 4 سېلسىيە گرادۇستا GFP-Trap_A (ChromoTek) بىلەن بىر كېچە ئىنتۇباتسىيە قىلىندى. SDS-PAGE ئارقىلىق ئايرىلغان تازىلانغان Gas1-GFP Coomassie پارقىراق كۆك رەڭ بىلەن بوялدى. Gas1-GFP رەڭ بېرىش لېنتى سۇ يولىنىڭ ئەتراپىدىكى كۈلرەڭ رەڭدىن ئۈزۈلۈپ، ئاندىن يودوئاتسېتامىد بىلەن ئالكىللىنىپ، دىتىئوترېئىتول بىلەن قايتۇرۇلغاندىن كېيىن، ترىپسىن بىلەن گېل ئىچىدە پارچىلاش ئېلىپ بېرىلدى. GPI-گلىكانلار بىلەن تىرىپتىك پېپتىدلار ۋە پېپتىدلارنى ئايرىش ۋە قۇرۇتۇش. قۇرۇتۇلغان پېپتىد 20 μl سۇدا ئېرىتىلدى. بىر قىسىم (8μl) LC غا قۇيۇلدى. ئالاھىدە گرادىيېنت شارائىتىدا پېپتىدلارنى ئايرىش ئۈچۈن ئوكتادېتسىلسىلان (ODS) تۈۋرۈكى (Develosil 300ODS-HG-5؛ ئىچكى دىئامېتىرى 150 mm×1.0 mm؛ Nomura Chemical، ئەيچى ناھىيەسى، ياپونىيە) ئىشلىتىلدى. ھەرىكەتچان باسقۇچ A ئېرىتكۈچى (%0.08 فورمىك كىسلاتا) ۋە B ئېرىتكۈچى (%0.15 فورمىك كىسلاتاسى %80 ئاتسېتونىترىلدا). Accela HPLC سىستېمىسى (Thermo Fisher Scientific، بوستون، ماسساچۇسېتس) ئارقىلىق تۈۋرۈك A ئېرىتكۈچى بىلەن 55 مىنۇت ئىچىدە 50 μl min-1 ئېقىم سۈرئىتىدە ئېرىتىلدى، ئاندىن B ئېرىتكۈچىنىڭ قويۇقلۇقى %40 كە يەتكۈزۈلدى. (ئامېرىكا). ئېرىتكۈچى ESI ئىئون مەنبەسىگە ئۈزلۈكسىز كىرگۈزۈلدى، ھەمدە تىرىپتىك پېپتىدلار ۋە GPI-گلىكان قوشۇلغان پېپتىدلار LTQ Orbitrap XL (گىبرىد سىزىقلىق ئىئون تۇزاق-ئوربىتاپ ماسسا سپېكترومېتىرى؛ Thermo Fisher Scientific) ئارقىلىق ئانالىز قىلىندى. MS قۇرۇلمىسىدا، كاپىللا مەنبەسىنىڭ توك بېسىمى 4.5 kV غا تەڭشەلدى، يۆتكىلىش كاپىللاسىنىڭ تېمپېراتۇرىسى 300°C دا ساقلاندى. كاپىللا توك بېسىمى ۋە تۇرۇبا لىنزىسىنىڭ توك بېسىمى ئايرىم-ئايرىم ھالدا 15 V ۋە 50 V غا تەڭشەلدى. MS سانلىق مەلۇماتلىرى مۇسبەت ئىئون ھالىتىدە (ئېنىقلىقى 60،000؛ ماسسا توغرىلىقى مىليوندا 10 قىسىم) 300/m/z ماسسا/زارياد نىسبىتى (m/z) 3000 ماسسا دائىرىسىدە قولغا كەلتۈرۈلدى. MS/MS سانلىق مەلۇماتلىرى LTQ Orbitrap XL دىكى ئىئون تۇزىقى ئارقىلىق قولغا كەلتۈرۈلدى [سانلىق مەلۇماتنىڭ دەسلەپكى 3 خانىلىق سانى، سوقۇلۇش كەلتۈرۈپ چىقارغان پارچىلىنىش (CID)].
MD سىمۇلياتسىيەسى GROMACS (52) يۇمشاق دېتالى ۋە MARTINI 2 كۈچ مەيدانى (53-55) ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى. ئاندىن CHARMM GUI پەردە قۇرغۇچىسى (56، 57) دىئولېئوئىلفوسفاتىدىلخولىن (DOPC) ۋە Cer C18 ياكى DOPC ۋە Cer C26 نى ئۆز ئىچىگە ئالغان قوش قەۋەتلىك قۇرۇلما ياساشقا ئىشلىتىلدى. Cer C26 نىڭ توپولوگىيەسى ۋە كوئوردېناتلىرى DXCE دىن سىفىڭگوزىن قۇيرۇقىدىكى ئارتۇق مارجانلارنى چىقىرىۋېتىش ئارقىلىق چىقىرىلىدۇ. قوش قەۋەتنى تەڭپۇڭلاشتۇرۇش ۋە ئۇنى ئىجرا قىلىش ئۈچۈن تۆۋەندە تەسۋىرلەنگەن جەرياننى ئىشلىتىڭ، ئاندىن سىستېمىنىڭ ئەڭ ئاخىرقى كوئوردېناتلىرىنى ئىشلىتىپ Emp24 نى ئۆز ئىچىگە ئالغان سىستېما قۇرۇڭ. خېمىر Emp24 نىڭ ترانسمېبران رايونى (173 دىن 193 گىچە بولغان قالدۇقلار) كۆرۈش MD (VMD) قورالى مولېكۇلا قۇرۇلمىسى (58) ئارقىلىق α-سپېرال شەكلىدە قۇرۇلدى. ئاندىن، قاپلانغان مايلارنى چىقىرىۋەتكەندىن كېيىن، ئاقسىل قېلىن دانچە قىلىنىپ، CHARMM GUI ئارقىلىق قوش قەۋەتكە كىرگۈزۈلدى. ئاخىرقى سىستېما 1202 DOPC ۋە 302 Cer C26 ياكى 1197 DOPC ۋە 295 Cer C18 ۋە Emp24 نى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ. سىستېمىنى 0.150M قويۇقلۇقتا ئىئونلاشتۇرۇڭ. ئىككى قەۋەتلىك تەركىب ئۈچۈن تۆت مۇستەقىل تەكرارلاش ئۇسۇلى ياسالدى.
لىپىد قوش قەۋىتى CHARMM GUI جەريانى ئارقىلىق تەڭپۇڭلاشتۇرۇلىدۇ، بۇ جەريان 405،000 قەدەمنى ئەڭ تۆۋەن چەككە چۈشۈرۈش ۋە ئاندىن تەڭپۇڭلاشتۇرۇشنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ، بۇ جەرياندا ئورۇن چەكلىمىسى تەدرىجىي ئازايتىلىدۇ ۋە يوقىتىلىدۇ، ۋاقىت قەدىمى 0.005 ps دىن 0.02 ps گىچە ئاشۇرۇلىدۇ. تەڭپۇڭلاشتۇرۇلغاندىن كېيىن، ۋاقىت قەدىمى 0.02 ps بولغان 6 µs ھاسىل قىلىدۇ. Emp24 نى كىرگۈزگەندىن كېيىن، سىستېمىنى ئەڭ تۆۋەن چەككە چۈشۈرۈش ۋە تەڭپۇڭلاشتۇرۇش ئۈچۈن ئوخشاش CHARMM GUI جەريانىنى ئىشلىتىڭ، ئاندىن ئىشلەپچىقىرىش جەريانىدا 8 سېكۇنت ئىجرا قىلىڭ.
بارلىق سىستېمىلار ئۈچۈن، تەڭپۇڭلاشتۇرۇش جەريانىدا، بېسىم بېرېندسېن باروستاتى (59) تەرىپىدىن كونترول قىلىنىدۇ، ئىشلەپچىقىرىش جەريانىدا بېسىم پاررىنېللو-راھمان باروستاتى (60) تەرىپىدىن كونترول قىلىنىدۇ. بارلىق ئەھۋاللاردا، ئوتتۇرىچە بېسىم 1 بار بولۇپ، يېرىم ئىزوتروپىك بېسىم بىرلەشتۈرۈش لايىھىسى ئىشلىتىلىدۇ. تەڭپۇڭلاشتۇرۇش ۋە ئىشلەپچىقىرىش جەريانىدا، ئاقسىل، ماي ۋە ئېرىتكۈچى زەررىچىلىرىنىڭ تېمپېراتۇرىسىنى ئايرىم-ئايرىم ھالدا بىرلەشتۈرۈش ئۈچۈن سۈرئەتنى قايتا تەڭشەش ئىقتىدارىغا ئىگە تېرموستات (61) ئىشلىتىلىدۇ. پۈتۈن مەشغۇلات جەريانىدا، نىشان تېمپېراتۇرىسى 310K بولىدۇ. باغلىنىشسىز ئۆز-ئارا تەسىر 0.005 بۇففېر بەرداشلىق بېرىش ئىقتىدارىغا ئىگە ۋېرلېت لايىھىسى ئارقىلىق جۈپلىشىش تىزىملىكى ھاسىل قىلىش ئارقىلىق ھېسابلىنىدۇ. كولومب تېرمى رېئاكسىيە مەيدانى ۋە 1.1 نانومېتىر كېسىش ئارىلىقى ئارقىلىق ھېسابلىنىدۇ. ۋاندېر ۋائالس تېرمى 1.1 نانومېتىر كېسىش ئارىلىقى بولغان كېسىش لايىھىسىنى ئىشلىتىدۇ، ۋېرلېت كېسىش لايىھىسى بولسا يوشۇرۇن يۆتكىلىش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدۇ (62).
VMD ئارقىلىق، DOPC فوسفات مارجانلىرى ياكى سېرامىد AM1 مارجانلىرى بىلەن ئاقسىل ئوتتۇرىسىدىكى كېسىش دولقۇن ئۇزۇنلۇقى 0.7 nm بولۇپ، ئاقسىل بىلەن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىدىغان مايلارنىڭ سانى ھېسابلىنىدۇ. تۆۋەندىكى فورمۇلاغا ئاساسەن، (63) دىكىدەك تۈگىتىش-بايىتىش (DE) ئامىلىنى ھېسابلاڭ: DE ئامىلى = (ئاقسىلدىكى ئومۇمىي مايلارنىڭ مىقدارى 0.7) ئاقسىلدىكى 0.7 (ئومۇمىي مايلاردىكى Cer مىقدارى)
دوكلات قىلىنغان قىممەت ئوتتۇرىچە قىممەت سۈپىتىدە ئېرىشىلىدۇ، خاتالىق بالداقلىرى SE نىڭ تۆت مۇستەقىل نۇسخىسى. DE ئامىلىنىڭ ستاتىستىكىلىق ئەھمىيىتى t سىنىقى [(ئوتتۇرا DE-فاكتور-1)/SE] ئارقىلىق ھېسابلىنىدۇ. بىر تەرەپلىك تەقسىماتتىن P قىممىتىنى ھېسابلاڭ.
GROMACS قورالى ئىزنىڭ ئاخىرقى 250 ns ئىچىدە Emp24 نى ئۆز ئىچىگە ئالغان سىستېمىنىڭ 2D يان تەرەپ زىچلىق خەرىتىسىنى ھېسابلاشقا ئىشلىتىلدى. سېرامىدنىڭ موللىشىش/خاملىنىش خەرىتىسىنى ئېلىش ئۈچۈن، Cer نىڭ زىچلىق خەرىتىسىنى Cer ۋە DOPC خەرىتىسىنىڭ يىغىندىسىغا، ئاندىن بەدەندىكى Cer نىڭ قويۇقلۇقىغا بۆلىدۇ. ئوخشاش رەڭلىك خەرىتە ئۆلچىمى ئىشلىتىلىدۇ.
بۇ ماقالىگە ئائىت قوشۇمچە ماتېرىياللار ئۈچۈن، http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 غا قاراڭ.
بۇ Creative Commons Attribution-Non-Commercial License شەرتلىرى بويىچە تارقىتىلغان ئوچۇق كىرىشلىك ماقالە بولۇپ، ئاخىرقى ئىشلىتىش سودا مەقسىتىدە بولمىغان ۋە ئەسلى ئەسەرنىڭ توغرا بولۇشى شەرت قىلىنغان ئەھۋالدا ھەر قانداق ۋاسىتە ئارقىلىق ئىشلىتىشكە، تارقىتىشقا ۋە كۆپەيتىشكە يول قويۇلىدۇ. پايدىلىنىش ئۈچۈن پايدىلىنىڭ.
ئەسكەرتىش: بىز پەقەت ئېلخەت ئادرېسىڭىزنى بېرىشىڭىزنى تەلەپ قىلىمىز، شۇنداق بولغاندا بەتكە تەۋسىيە قىلغان كىشى ئېلخەتنى كۆرۈشنى خالايدىغانلىقىڭىزنى ۋە ئۇنىڭ ئەخلەت ئەمەسلىكىنى بىلىدۇ. بىز ھېچقانداق ئېلخەت ئادرېسىنى خاتىرىلىمەيمىز.
بۇ سوئال سىزنىڭ زىيارەتچى ئىكەنلىكىڭىزنى سىناش ۋە ئاپتوماتىك ھالدا ئەخلەت ئۇچۇر يوللاشنىڭ ئالدىنى ئېلىش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدۇ.
سوفىيە رودرىگۇز-گاللاردو ، كازۇئو كۇروكاۋا ، سۇسانا سابىدو-بوزو ، ئالېجاندرو كورتىز · گومېز (ئالېجاندرو كورتىس-گومېز) ، ئاتسۇكو ئىكېدا (ئاتسۇكو ئىكېدا) ، ۋالېرىيە زونى (ۋالېرىيە زونى) ، ئاۋسىلىئادورا ئاگۇيلېرا-رومېرو ، ئانېرېلا مارىئا لوپېز) ، مىخو ۋاگا (مىخو ۋاگا) ، مىساكو ئارمان (مىساكو ئارمان) ، مىياكو رىمان (مىياكو رىمان) ، پروۋ ئاكىرا ، ستېفانو فەننىي ، ئاكىخىكو ناكانو ، مانۇئېل مۇنىز
3D يۇقىرى ئېنىقلىقتىكى ھەقىقىي ۋاقىتلىق سۈرەتكە تارتىش، تاللانغان چىقىرىش ئورۇنلىرىدا ئاقسىلنى تۈرگە ئايرىشتا سېرامىد زەنجىرى ئۇزۇنلۇقىنىڭ مۇھىملىقىنى ئاشكارىلىدى.
سوفىيە رودرىگۇز-گاللاردو ، كازۇئو كۇروكاۋا ، سۇسانا سابىدو-بوزو ، ئالېجاندرو كورتىز · گومېز (ئالېجاندرو كورتىس-گومېز) ، ئاتسۇكو ئىكېدا (ئاتسۇكو ئىكېدا) ، ۋالېرىيە زونى (ۋالېرىيە زونى) ، ئاۋسىلىئادورا ئاگۇيلېرا-رومېرو ، ئانېرېلا مارىئا لوپېز) ، مىخو ۋاگا (مىخو ۋاگا) ، مىساكو ئارمان (مىساكو ئارمان) ، مىياكو رىمان (مىياكو رىمان) ، پروۋ ئاكىرا ، ستېفانو فەننىي ، ئاكىخىكو ناكانو ، مانۇئېل مۇنىز
3D يۇقىرى ئېنىقلىقتىكى ھەقىقىي ۋاقىتلىق سۈرەتكە تارتىش، تاللانغان چىقىرىش ئورۇنلىرىدا ئاقسىلنى تۈرگە ئايرىشتا سېرامىد زەنجىرى ئۇزۇنلۇقىنىڭ مۇھىملىقىنى ئاشكارىلىدى.
© 2020 ئامېرىكا ئىلىم-پەننى ئىلگىرى سۈرۈش جەمئىيىتى. بارلىق ھوقۇقلار قوغدىلىدۇ. AAAS بولسا HINARI ، AGORA ، OARE ، CHORUS ، CLOCKSS ، CrossRef ۋە COUNTER نىڭ ھەمكارلاشقۇچىسى. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.