ھازىرقى *ھازىرقى ئادرېسى: گېرمانىيەنىڭ كولون شەھىرى 50931، كولون مۇنەۋۋەرلىك توپلام تەتقىقاتى، قېرىشقا مۇناسىۋەتلىك كېسەللىكلەردە ھۈجەيرە بېسىمىغا تاقابىل تۇرۇش (CECAD).
مىتوخوندىرىيە كېسەللىكلىرىنىڭ نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنىڭ چېكىنىشى قايتۇرغىلى بولمايدىغان دەپ قارىلىدۇ، چۈنكى نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنىڭ ماددا ئالمىشىشچانلىقى چەكلىك، ئەمما مىتوخوندىرىيە ئىقتىدارىنىڭ قالايمىقانلىشىشىنىڭ بەدەندىكى نېرۋا ماددا ئالمىشىشىنىڭ ھۈجەيرە ئاپتونومىيىسىگە بولغان تەسىرى ئانچە ئېنىق ئەمەس. بۇ يەردە، بىز مىتوخوندىرىيە قوشۇلۇش دىنامىكىسىنىڭ بۇزۇلۇشى سەۋەبىدىن كېلىپ چىققان ئىلگىرىلەيدىغان OXPHOS كەمچىللىكى بار پۇركىنجې نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنىڭ ھۈجەيرىگە خاس پروتېئومىسىنى تونۇشتۇرىمىز. بىز مىتوخوندىرىيە ئىقتىدارىنىڭ قالايمىقانلىشىشى پروتېئومىكا ساھەسىدە چوڭقۇر ئۆزگىرىش پەيدا قىلغانلىقىنى، ئاخىرىدا ھۈجەيرە ئۆلۈشتىن بۇرۇن ئېنىق ماددا ئالمىشىش پروگراممىلىرىنىڭ ئارقا-ئارقىدىن ئاكتىپلىنىشىغا ئېلىپ كەلگەنلىكىنى بايقىدۇق. كۈتۈلمىگەندە، بىز پىرۇۋات كاربونسىلازا (PCx) ۋە TCA دەۋرىيلىكىنىڭ ئارىلىق مەھسۇلاتلىرىنى تولۇقلايدىغان باشقا قېرىشقا قارشى ئېنزىملارنىڭ روشەن قوزغىلىشىنى بايقىدۇق. PCx نىڭ چەكلىنىشى ئوكسىدلىنىش سترېسى ۋە نېرۋا ئىقتىدارىنىڭ چېكىنىشىنى كۈچەيتتى، بۇ ئاتلېروسېكلورىزمنىڭ OXPHOS كەمچىل بولغان نېرۋا ھۈجەيرىلىرىدە قوغداش رولى بارلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. ئاخىرقى چېكىنىشلىك نېرۋا ھۈجەيرىلىرىدە مىتوخوندىرىيە قوشۇلۇشىنىڭ ئەسلىگە كېلىشى بۇ ماددا ئالمىشىش ئالاھىدىلىكلىرىنى پۈتۈنلەي ئۆزگەرتىدۇ، شۇنىڭ بىلەن ھۈجەيرە ئۆلۈشىنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ. بىزنىڭ بايقاشلىرىمىز مىتوخوندىرىيە ئىقتىدارىنىڭ قالايمىقانلىشىشىغا چىداملىق بولغان ئىلگىرى نامەلۇم يوللارنى ئېنىقلىدى ۋە كېسەللىكنىڭ ئاخىرقى باسقۇچلىرىدىمۇ نېرۋا ئىقتىدارىنىڭ چېكىنىشىنى ئەسلىگە كەلتۈرگىلى بولىدىغانلىقىنى كۆرسەتتى.
مىتوخوندىرىيەنىڭ نېرۋا ئېنېرگىيەسى ماددا ئالمىشىشىنى ساقلاشتىكى مەركىزىي رولى ئىنسانلارنىڭ مىتوخوندىرىيە كېسەللىكلىرى بىلەن مۇناسىۋەتلىك كەڭ كۆلەملىك نېرۋا ئالامەتلىرى بىلەن گەۋدىلىنىدۇ. بۇ كېسەللىكلەرنىڭ كۆپىنچىسى مىتوخوندىرىيە گېنىنىڭ ئىپادىلىنىشىنى تەڭشەيدىغان گېن مۇتاتسىيەسى (1، 2) ياكى مىتوخوندىرىيە دىنامىكىسىغا مۇناسىۋەتلىك گېننىڭ بۇزۇلۇشى سەۋەبىدىن كېلىپ چىقىدۇ، بۇلار مىتوخوندىرىيە DNA (mtDNA) نىڭ مۇقىملىقىغا ۋاسىتىلىك تەسىر كۆرسىتىدۇ (3، 4). ھايۋانات مودېللىرىدىكى تەتقىقاتلار شۇنى كۆرسەتتىكى، ئەتراپتىكى توقۇلمىلاردىكى مىتوخوندىرىيە ئىقتىدارىنىڭ قالايمىقانلىشىشىغا جاۋابەن، كونسېرۋاتىپ ماددا ئالمىشىش يوللىرى (5-7) قوزغىتىلىدۇ، بۇ بۇ مۇرەككەپ كېسەللىكلەرنىڭ پاتوگېنىزىنى چوڭقۇر چۈشىنىش ئۈچۈن مۇھىم ئۇچۇرلار بىلەن تەمىنلەيدۇ. بۇنىڭ ئەكسىچە، مېڭە مىتوخوندىرىيە ئادېنوزىن ترىفوسفات (ATP) ئىشلەپچىقىرىشنىڭ ئومۇمىي مەغلۇبىيىتى سەۋەبىدىن كېلىپ چىققان مەلۇم ھۈجەيرە تىپلىرىنىڭ ماددا ئالمىشىش ئۆزگىرىشلىرىنى چۈشىنىشىمىز ئاساسىي (8) بولۇپ، كېسەللىكنىڭ ئالدىنى ئېلىش ياكى ئالدىنى ئېلىش ئۈچۈن ئىشلىتىشكە بولىدىغان داۋالاش نىشانلىرىنى ئېنىقلاشنىڭ زۆرۈرلۈكىنى تەكىتلەيدۇ. نېرۋا چېكىنىشىنىڭ ئالدىنى ئېلىش (9). ئۇچۇرنىڭ كەمچىللىكى شۇكى، نېرۋا ھۈجەيرىلىرى ئەتراپتىكى توقۇلمىلارنىڭ ھۈجەيرە تىپلىرىغا سېلىشتۇرغاندا ماددا ئالمىشىش ئىقتىدارىنىڭ ئىنتايىن چەكلىك ئىكەنلىكى كەڭ كۆلەمدە قارىلىدۇ (10). بۇ ھۈجەيرىلەر نېرۋا ھۈجەيرىلىرىگە مېتابولىتلارنىڭ يەتكۈزۈلۈشىنى ماسلاشتۇرۇشتا مۇھىم رول ئوينايدىغانلىقى ئۈچۈن، سىناپس يەتكۈزۈشنى ئىلگىرى سۈرۈش ۋە يارىلىنىش ۋە كېسەللىك ئەھۋاللىرىغا جاۋاب قايتۇرۇش ئۈچۈن، ھۈجەيرە ماددا ئالمىشىشىنى مېڭە توقۇلمىسىنىڭ قىيىن ئەھۋاللىرىغا ماسلاشتۇرۇش ئىقتىدارى دېگۈدەك گلىيا ھۈجەيرىلىرى بىلەنلا چەكلىنىدۇ (11-14). بۇنىڭدىن باشقا، مېڭە توقۇلمىسىنىڭ ھۈجەيرە جەھەتتىكى كۆپ خىللىقى مەلۇم نېرۋا كىچىك گۇرۇپپىلىرىدا يۈز بېرىدىغان ماددا ئالمىشىش ئۆزگىرىشلىرىنى تەتقىق قىلىشقا زور دەرىجىدە توسقۇنلۇق قىلىدۇ. نەتىجىدە، نېرۋا ھۈجەيرىلىرىدىكى مىتوخوندىرىيە ئىقتىدارىنىڭ قالايمىقانلىشىشىنىڭ ئېنىق ھۈجەيرە ۋە ماددا ئالمىشىش ئاقىۋەتلىرى توغرىسىدا ئاز نەرسە مەلۇم.
مىتوخوندىرىيە ئىقتىدارىنىڭ قالايمىقانلىشىشىنىڭ ماددا ئالمىشىش ئاقىۋىتىنى چۈشىنىش ئۈچۈن، بىز مىتوخوندىرىيە تاشقى پەردىسىنىڭ بىرىكمىسى (Mfn2) نىڭ بۇزۇلۇشى سەۋەبىدىن كېلىپ چىققان نېرۋا چېكىنىشىنىڭ ھەر خىل باسقۇچلىرىدىكى پۇركىنجې نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنى (PN) ئايرىۋالدۇق. ئىنسانلاردىكى Mfn2 مۇتاتسىيەسى Charcot-Marie-Tooth تىپى 2A (15) دەپ ئاتىلىدىغان بىر خىل ئىرسىي ھەرىكەت سېزىم نېرۋا كېسىلى بىلەن مۇناسىۋەتلىك بولسىمۇ، چاشقانلاردا Mfn2 نىڭ شەرتلىك بۇزۇلۇشى ئوكسىدلىنىشنىڭ فوسفورلىنىش (OXPHOS) ئىقتىدارىنىڭ قالايمىقانلىشىشىنىڭ ئومۇمەن ئېتىراپ قىلىنغان بىر ئۇسۇلى. ھەر خىل نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنىڭ تارماق تىپلىرى (16-19) ۋە نەتىجىدە پەيدا بولغان نېرۋا چېكىنىش فېنوتىپى ھەرىكەت قالايمىقانلىشىشى (18، 19) ياكى كىچىك مېڭە ئاتاكسىيەسى (16) قاتارلىق ئىلگىرىلەشچان نېرۋا ئالامەتلىرى بىلەن بىللە كېلىدۇ. بەلگىسىز مىقدارلىق (LFQ) پروتېئومىكا، ماددا ئالمىشىش، رەسىمگە تارتىش ۋە ۋىرۇسولوگىيەلىك ئۇسۇللارنى بىرلەشتۈرۈپ ئىشلىتىش ئارقىلىق، ئىلگىرىلەشچان نېرۋا چېكىنىشىنىڭ پىرۇۋات كاربونسىلازا (PCx) ۋە PN لارنىڭ ئارتېرىيە قېتىشىشىغا چېتىشلىق باشقا ئامىللارنى كۈچلۈك قوزغىتىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بەردۇق. ئىنزىملارنىڭ ئىپادىلىنىشى. بۇ بايقاشنىڭ مۇناسىۋەتلىكلىكىنى جەزملەشتۈرۈش ئۈچۈن، بىز Mfn2 كەمچىل PN لاردا PCx نىڭ ئىپادىلىنىشىنى ئالاھىدە تۆۋەنلىتىپ، بۇ ئوپېراتسىيەنىڭ ئوكسىدلىنىش سترېسىنى كۈچەيتىۋەتكەنلىكىنى ۋە نېرۋا چېكىنىشىنى تېزلەشتۈرگەنلىكىنى بايقىدۇق، شۇڭا ئازوئوسپېرمىيەنىڭ ھۈجەيرە ئۆلۈمىنىڭ ماددا ئالمىشىش ماسلىشىشىنى تەمىنلەيدىغانلىقىنى ئىسپاتلىدۇق. MFN2 نىڭ ئېغىر ئىپادىلىنىشى ئېغىر OXPHOS كەمچىللىكى، مىتوخوندىرىيە DNA نىڭ كۆپ مىقداردا ئىستېمال قىلىنىشى ۋە مىتوخوندىرىيە تورىنىڭ بۇزۇلغانلىقى بىلەن ئاخىرلىشىش باسقۇچىدىكى چېكىنىش PN نى تولۇق قۇتقۇزالايدۇ، بۇ يەنە بۇ خىل نېرۋا چېكىنىشىنىڭ ھۈجەيرە ئۆلۈشتىن بۇرۇن كېسەللىكنىڭ ئېغىر باسقۇچىدىمۇ ئەسلىگە كېلەلەيدىغانلىقىنى تەكىتلەيدۇ.
Mfn2 نوكاۋت PN لىرىدىكى مىتوخوندىرىيەنى كۆرۈنۈش ئۈچۈن، بىز Cre غا تايىنىدىغان مىتوخوندىرىيەنىڭ سېرىق فلۇئورېسسېنت ئاقسىلى (YFP) (mtYFP) (20) Cre ئىپادىسىنى نىشان قىلىشىغا يول قويىدىغان چاشقان تۈرىنى ئىشلەتتۇق ۋە مىتوخوندىرىيە مورفولوگىيەسىنى تىرىك جانلىقلاردا تەكشۈردۇق. بىز PN لاردا Mfn2 گېنىنىڭ بۇزۇلۇشى مىتوخوندىرىيە تورىنىڭ تەدرىجىي بۆلۈنۈشىگە ئېلىپ كېلىدىغانلىقىنى بايقىدۇق (S1A-رەسىم)، ۋە ئەڭ دەسلەپكى ئۆزگىرىش 3 ھەپتىلىك ياشتا بايقالغان. ئەكسىچە، كالبىندىن ئىممۇنىتېت رەڭگىنىڭ يوقىلىشىدىن كۆرۈۋېلىشقا بولىدۇكى، PN ھۈجەيرە قەۋىتىنىڭ زور دەرىجىدە چېكىنىشى 12 ھەپتىلىك ياشقىچە باشلانمىغان (1-رەسىم، A ۋە B). مىتوخوندىرىيە مورفولوگىيەسىدىكى ئەڭ دەسلەپكى ئۆزگىرىشلەر بىلەن نېرۋا ئۆلۈمىنىڭ كۆرۈنگەن باشلىنىشى ئوتتۇرىسىدىكى ۋاقىت ماس ​​كەلمەسلىكى بىزنى ھۈجەيرە ئۆلۈشتىن بۇرۇن مىتوخوندىرىيە ئىقتىدارىنىڭ قالايمىقانلىشىشى كەلتۈرۈپ چىقارغان ماددا ئالمىشىش ئۆزگىرىشلىرىنى تەكشۈرۈشكە ئۈندىدى. بىز YFP (YFP+) ئىپادىلەيدىغان PN نى ئايرىش ئۈچۈن فلۇئورېسسېنسىيە ئاكتىپلاشتۇرۇلغان ھۈجەيرە تۈرگە ئايرىش (FACS) ئاساسىدىكى ئىستراتېگىيە ئىجاد قىلدۇق (1C-رەسىم)، ھەمدە كونترول چاشقانلىرىدا (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre)، بۇنىڭدىن كېيىن CTRL دەپ ئاتىلىدۇ (S1B-رەسىم). YFP سىگنالىنىڭ نىسپىي كۈچلۈكلۈكىگە ئاساسەن دەرۋازا ئىستراتېگىيەسىنى ئەلالاشتۇرۇش بىزگە YFP+ گەۋدىسىنى (YFPhigh) PN لاردىن PN بولمىغانلاردىن (YFPneg) (S1B-رەسىم) ياكى پەرەز قىلىنغان فلۇئورېسسېنسىيەلىك ئاكسون/دېندرىت پارچىلىرىدىن (YFPlow؛ S1D-رەسىم، سول تەرەپ) تازىلاشقا يول قويىدۇ، بۇ كونفوكال مىكروسكوپ ئارقىلىق دەلىللەنگەن (S1D-رەسىم، ئوڭ تەرەپ). تۈرگە ئايرىلغان توپنىڭ كىملىكىنى جەزملەشتۈرۈش ئۈچۈن، بىز LFQ پروتېئومىكىسى ۋە ئاندىن ئاساسلىق تەركىب ئانالىزىنى ئېلىپ باردۇق ۋە YFPhigh بىلەن YFPneg ھۈجەيرىلىرى ئوتتۇرىسىدا ئېنىق پەرق بارلىقىنى بايقىدۇق (S1C-رەسىم). YFPhigh ھۈجەيرىلىرى مەلۇم PN بەلگىلىرىنىڭ (يەنى Calb1، Pcp2، Grid2 ۋە Itpr3) ساپ موللۇقىنى كۆرسەتتى (21، 22)، ئەمما نېرۋا ھۈجەيرىلىرى ياكى باشقا ھۈجەيرە تىپلىرىدا كۆپ ئىپادىلىنىدىغان ئاقسىللارنىڭ موللۇقىنى كۆرسەتمىدى (1D-رەسىم). مۇستەقىل تەجرىبىلەردە توپلانغان تۈرگە ئايرىلغان YFPhigh ھۈجەيرىلىرىدىكى ئەۋرىشكىلەرنى سېلىشتۇرۇش ئارقىلىق، كوررېلياتسىيە كوئېففىتسېنتى > 0.9 بولۇپ، بىئولوگىيىلىك تەكرارلىنىشلار ئارىسىدا ياخشى قايتا ئىشلەپچىقىرىش ئىقتىدارىنى نامايان قىلدى (S1E-رەسىم). قىسقىسى، بۇ سانلىق مەلۇماتلار مۇمكىن بولغان PN نى ئۆتكۈر ۋە ئالاھىدە ئايرىش پىلانىمىزنى جەزملەشتۈردى. ئىشلىتىلگەن L7-cre قوزغاتقۇچ سىستېمىسى تۇغۇتتىن كېيىنكى تۇنجى ھەپتىدە موزايكا قايتا بىرىكمىسىنى قوزغىتىدىغان بولغاچقا (23)، بىز CTRL دىن چاشقانلارنى يوقىتىشقا باشلىدۇق ۋە شەرتلىك (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنى توپلىدۇق. قايتا بىرىكمە تاماملانغاندىن كېيىن، 4 ھەپتىلىك بولغاندا Mfn2cKO دەپ ئاتىلىدۇ. ئاخىرقى نۇقتا سۈپىتىدە، بىز PN قەۋىتىنىڭ مىتوخوندىرىيە پارچىلىنىشى روشەن بولسىمۇ، پۈتۈن بولغان 8 ھەپتىلىك ياشنى تاللىدۇق (1B-رەسىم ۋە S1A-رەسىم). جەمئىي 3013 ئاقسىلنى مىقدارلاشتۇردۇق، بۇنىڭ ئىچىدە تەخمىنەن %22 مىتوخوندىرىيە ئاقسىلىنىڭ مىتوخوندىرىيە سۈپىتىدە ئىشلىتىلىشىگە ئاساسەن MitoCarta 2.0 ئىزاھاتلىرىغا ئاساسلانغان (1E-رەسىم) (1E-رەسىم) (24). 8-ھەپتىدە ئېلىپ بېرىلغان پەرقلىق گېن ئىپادىلەش ئانالىزى بارلىق ئاقسىللارنىڭ پەقەت %10.5 ىدە مۇھىم ئۆزگىرىش بولغانلىقىنى كۆرسەتتى (1F-رەسىم ۋە S1F-رەسىم)، بۇنىڭ ئىچىدە 195 ئاقسىلنىڭ تەڭشىلىشى تۆۋەنلىگەن، 120 ئاقسىلنىڭ تەڭشىلىشى ئاشقان (1F-رەسىم). بۇ سانلىق مەلۇماتلار توپلىمىنىڭ «يېڭىلىق يارىتىش يول ئانالىزى» پەرقلىق ئىپادىلەنگەن گېنلارنىڭ ئاساسلىقى چەكلىك بىر يۈرۈش ئالاھىدە ماددا ئالمىشىش يوللىرىغا تەۋە ئىكەنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ (1G-رەسىم). قىزىقارلىقى شۇكى، OXPHOS ۋە كالتسىي سىگنالى بىلەن مۇناسىۋەتلىك يوللارنىڭ تۆۋەنلىشى بىرىكمە كەمچىل PN لاردا مىتوخوندىرىيە ئىقتىدارىنىڭ قالايمىقانلىشىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغانلىقىنى جەزملەشتۈرسىمۇ، ئاساسلىقى ئامىنو كىسلاتاسى مېتابولىزمى بىلەن مۇناسىۋەتلىك باشقا تۈرلەر كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە ئېشىپ كەتكەن، بۇ مىتوخوندىرىيە PN لاردا يۈز بېرىدىغان مېتابولىزمغا ماس كېلىدۇ. قايتا سىم ئورنىتىش ئىزچىل.
(A) CTRL ۋە Mfn2cKO چاشقانلىرىنىڭ كىچىك مېڭە قىسىملىرىنىڭ ۋەكىللىك كونفوكال سۈرەتلىرى PN لارنىڭ تەدرىجىي يوقىلىشىنى كۆرسىتىدۇ (كالبىندىن، كۈلرەڭ)؛ يادرولىرى DAPI بىلەن قارشى رەڭلەنگەن. (B) (A) نىڭ مىقدارلاشتۇرۇلۇشى (بىر تەرەپلىمە ئۆزگىرىش ئانالىزى، ***P<0.001؛ n = ئۈچ چاشقاندىن 4 دىن 6 گىچە چەمبەر). (C) تەجرىبە خىزمەت ئېقىمى. (D) پۇركىنجې (ئۈستى) ۋە باشقا ھۈجەيرە تىپلىرىغا (ئوتتۇرىدا) خاس بەلگىلەرنىڭ ئىسسىقلىق خەرىتىسىنىڭ تارقىلىشى. (E) تۈرگە ئايرىلغان PN دا بايقالغان مىتوخوندىرىيە ئاقسىللىرىنىڭ سانىنى كۆرسىتىدىغان ۋېنن دىئاگراممىسى. (F) 8 ھەپتىدە Mfn2cKO نېيرون ھۈجەيرىلىرىدىكى پەرقلىق ئىپادىلەنگەن ئاقسىللارنىڭ ۋولقان دىئاگراممىسى (مۇھىملىق چەك قىممىتى 1.3). (G) ئىجادچانلىق يولى ئانالىزى 8 ھەپتىلىك تۈرگە ئايرىلغان Mfn2cKO PN دىكى ئەڭ مۇھىم بەش يۇقىرى تەڭشەش (قىزىل) ۋە تۆۋەن تەڭشەش (كۆك) يولىنى كۆرسىتىدۇ. بايقالغان ھەر بىر ئاقسىلنىڭ ئوتتۇرىچە ئىپادىلىنىش سەۋىيەسى كۆرسىتىلدى. كۈلرەڭ ئىسسىقلىق خەرىتىسى: تەڭشەلگەن P قىممىتى. ns، مۇھىم ئەمەس.
پروتېئومىكا سانلىق مەلۇماتلىرى I، III ۋە IV مۇرەككەپ ماددىلىرىنىڭ ئاقسىل ئىپادىسىنىڭ تەدرىجىي تۆۋەنلىگەنلىكىنى كۆرسەتتى. I، III ۋە IV مۇرەككەپ ماددىلىرىنىڭ ھەممىسىدە مۇھىم mtDNA كودلانغان تارماق بىرلىكلىرى بار ئىدى، پەقەت يادرو كودلانغان II مۇرەككەپ ماددىسى ئاساسەن تەسىرگە ئۇچرىمىدى (2A-رەسىم ۋە S2A-رەسىم). پروتېئومىكا نەتىجىلىرىگە ماس ھالدا، كىچىك مېڭە توقۇلمىسى بۆلەكلىرىنىڭ ئىممۇنوگىستوخېمىيەسى PN دىكى IV مۇرەككەپ ماددىسىنىڭ MTCO1 (مىتوخوندىرىيە سىتوخروم C ئوكسىدازا تارماق بىرلىكى 1) تارماق بىرلىكى سەۋىيەسىنىڭ تەدرىجىي تۆۋەنلىگەنلىكىنى كۆرسەتتى (2B-رەسىم). mtDNA كودلانغان Mtatp8 تارماق بىرلىكى كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە تۆۋەنلىگەن (S2A-رەسىم)، يادرو كودلانغان ATP سىنتازا تارماق بىرلىكىنىڭ مۇقىم ھالىتى ئۆزگەرمىگەن، بۇ mtDNA ئىپادىسى مۇقىم بولغاندا مەلۇم بولغان مۇقىم ATP سىنتازا تارماق بىرلىكى F1 مۇرەككەپ بىرلىكى بىلەن ماس كېلىدۇ. شەكىللىنىش مۇقىم. ئۈزۈلۈش (7). تەرتىپلەنگەن Mfn2cKO PN لىرىدىكى mtDNA سەۋىيەسىنى ھەقىقىي ۋاقىتلىق پولىمېراز زەنجىرسىمان رېئاكسىيە (qPCR) ئارقىلىق باھالاش mtDNA كۆچۈرۈلمە سانىنىڭ ئاستا-ئاستا تۆۋەنلىگەنلىكىنى جەزملەشتۈردى. كونترول گۇرۇپپىسى بىلەن سېلىشتۇرغاندا، 8 ھەپتىلىك بولغاندا، mtDNA سەۋىيەسىنىڭ پەقەت %20 ى ساقلىنىپ قالغان (2C-رەسىم). بۇ نەتىجىلەرگە ماس ھالدا، Mfn2cKO PN لىرىنىڭ كونفوكال مىكروسكوپ بوياش ئۇسۇلى DNA نى بايقاش ئۈچۈن ئىشلىتىلدى، بۇ مىتوخوندىرىيە نۇكلېئوتىدلىرىنىڭ ۋاقىتقا باغلىق سەرپىياتىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ (2D-رەسىم). بىز مىتوخوندىرىيە ئاقسىلىنىڭ پارچىلىنىشى ۋە بېسىمغا تاقابىل تۇرۇشقا قاتناشقان بەزى كاندىداتلارنىڭلا يۇقىرىلىغانلىقىنى بايقىدۇق، بۇنىڭ ئىچىدە Lonp1، Afg3l2 ۋە Clpx ۋە OXPHOS مۇرەككەپ يىغىلىش ئامىللىرى بار. ئاپپتوزغا قاتناشقان ئاقسىللارنىڭ سەۋىيەسىدە مۇھىم ئۆزگىرىش بايقالمىغان (S2B-رەسىم). شۇنىڭغا ئوخشاش، بىز كالتسىي توشۇشقا قاتناشقان مىتوخوندىرىيە ۋە ئېندوپلازمىك تور قاناللىرىنىڭ پەقەت كىچىك ئۆزگىرىشلەرنىلا بايقىغانلىقىنى بايقىدۇق (S2C-رەسىم). بۇنىڭدىن باشقا، ئاپتوفاگىيەگە مۇناسىۋەتلىك ئاقسىللارنى باھالاشتا ھېچقانداق مۇھىم ئۆزگىرىش بايقالمىغان، بۇ ئىممۇنوگىستوخېمىيە ۋە ئېلېكترون مىكروسكوپ ئارقىلىق تىرىك جانلىقلاردا كۆزىتىلگەن ئاپتوفاگوسومالارنىڭ كۆرۈنەرلىك قوزغىلىشى بىلەن ماس كېلىدۇ (S3-رەسىم). قانداقلا بولمىسۇن، PN دىكى ئىلگىرىلەشچان OXPHOS ئىقتىدارىنىڭ قالايمىقانلىشىشى روشەن ئۇلترا قۇرۇلمىلىق مىتوخوندىرىيە ئۆزگىرىشلىرى بىلەن بىللە كېلىدۇ. 5 ۋە 8 ھەپتىلىك Mfn2cKO PN نىڭ ھۈجەيرە تېنى ۋە دېندرىت دەرەخلىرىدە مىتوخوندىرىيە توپلىرىنى كۆرگىلى بولىدۇ، ھەمدە ئىچكى پەردە قۇرۇلمىسى چوڭقۇر ئۆزگىرىشلەرگە ئۇچرىغان (S4، A ۋە B-رەسىم). بۇ ئۇلترا قۇرۇلمىلىق ئۆزگىرىشلەر ۋە mtDNA نىڭ كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە تۆۋەنلىشىگە ماس ھالدا، تېترامېتىلرودامىن مېتىل ئېستېر (TMRM) بىلەن ئۆتكۈر مېڭە كىچىك مېڭە پارچىلىرىنى تەھلىل قىلىش Mfn2cKO PN دىكى مىتوخوندىرىيە پەردە پوتېنسىيالى كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە تۆۋەنلىگەنلىكىنى كۆرسەتتى (S4C-رەسىم).
(A) OXPHOS بىرىكمىسىنىڭ ئىپادىلىنىش سەۋىيەسىنىڭ ۋاقىت جەريانى ئانالىزى. پەقەت 8 ھەپتىدە P<0.05 بولغان ئاقسىللارنىلا ئويلىشىڭ (ئىككى تەرەپلىك ANOVA). نۇقتىلىق سىزىق: CTRL بىلەن سېلىشتۇرغاندا تەڭشەش يوق. (B) سول تەرەپ: MTCO1 غا قارشى ئانتىتېلا بىلەن بەلگە قويۇلغان كىچىك مېڭە بۆلىكىنىڭ مىسالى (مىقدار بالداق، 20 μm). پۇركىنجې ھۈجەيرە جىسىملىرى ئىگىلىگەن بوشلۇق سېرىق رەڭ بىلەن قاپلانغان. ئوڭ تەرەپ: MTCO1 سەۋىيەسىنىڭ مىقدارلاشتۇرۇلۇشى (بىر تەرەپلىك ئۆزگىرىشچانلىق ئانالىزى؛ ئۈچ چاشقاندىن تەھلىل قىلىنغان n = 7 دىن 20 گىچە ھۈجەيرە). (C) تۈرگە ئايرىلغان PN دىكى mtDNA كۆچۈرۈلمە سانىنىڭ qPCR ئانالىزى (بىر تەرەپلىك ئۆزگىرىشچانلىق ئانالىزى؛ n = 3 دىن 7 گىچە چاشقان). (D) سول تەرەپ: DNA غا قارشى ئانتىتېلا بىلەن بەلگە قويۇلغان كىچىك مېڭە بۆلىكىنىڭ مىسالى (مىقدار بالداق، 20 μm). پۇركىنجې ھۈجەيرە جىسىملىرى ئىگىلىگەن بوشلۇق سېرىق رەڭ بىلەن قاپلانغان. ئوڭ تەرەپ: mtDNA زەخمىلىرىنىڭ مىقدارىنى بەلگىلەش (بىر تەرەپلىمە ئۆزگىرىشچانلىق ئانالىزى؛ ئۈچ چاشقاننىڭ 5 دىن 9 گىچە ھۈجەيرىسى). (E) پۈتۈن ھۈجەيرە ياماق قىسقۇچ خاتىرىسىدە mitoYFP + پۇركىنجې ھۈجەيرىلىرىنى كۆرسىتىدىغان ئۆتكۈر مېڭە كېسىشمىسىنىڭ مىسالى (كۆرسەتكۈچ). (F) IV ئەگرى سىزىقىنىڭ مىقدارىنى بەلگىلەش. (G) CTRL ۋە Mfn2cKO پۇركىنجې ھۈجەيرىلىرىگە قۇتۇپسىزلىنىش توك ئوكۇلىنىڭ ۋەكىللىك خاتىرىلىرى. ئۈستۈنكى ئىز: AP نى قوزغىغان تۇنجى ئىمپۇلس. ئاستىنقى ئىز: ئەڭ يۇقىرى AP چاستوتىسى. (H) سىناپستىن كېيىنكى ئۆزلۈكىدىن كىرىش (sPSP) نىڭ مىقدارىنى بەلگىلەش. ۋەكىللىك خاتىرىلەش ئىزى ۋە ئۇنىڭ چوڭايتىش نىسبىتى (I) دا كۆرسىتىلدى. ئۈچ چاشقاننىڭ n = 5 دىن 20 گىچە ھۈجەيرىسىنى تەھلىل قىلغان بىر تەرەپلىمە ئۆزگىرىشچانلىق ئانالىزى. سانلىق مەلۇماتلار ئوتتۇرىچە ± SEM شەكلىدە ئىپادىلىنىدۇ؛ *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) تۆشۈكلۈك ياماق قىسقۇچ ھالىتى ئارقىلىق خاتىرىلەنگەن ئۆزلۈكىدىن AP نىڭ ۋەكىللىك ئىزلىرى. ئۈستۈنكى ئىز: ئەڭ يۇقىرى AP چاستوتىسى. ئاستىنقى ئىز: يەككە AP نىڭ چوڭايتىش. (K) ئوتتۇرىچە ۋە ئەڭ چوڭ AP چاستوتىسىنى (J) غا ئاساسەن مىقدارلاشتۇرۇڭ. مان-ۋىتنىي سىنىقى؛ تۆت چاشقاندىن ئېلىنغان n = 5 ھۈجەيرە ئانالىز قىلىندى. سانلىق مەلۇماتلار ئوتتۇرىچە ± SEM شەكلىدە ئىپادىلىنىدۇ؛ مۇھىم ئەمەس.
8 ھەپتىلىك Mfn2cKO PN دا روشەن OXPHOS زەخمىلىنىشى بايقالدى، بۇ نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنىڭ فىزىئولوگىيىلىك ئىقتىدارىنىڭ ئېغىر دەرىجىدە نورمالسىز ئىكەنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. شۇڭا، بىز 4 ھەپتىدىن 5 ھەپتىگىچە ۋە 7 ھەپتىدىن 8 ھەپتىگىچە بولغان ئۆتكۈر مېڭە پارچىلىرىدا پۈتۈن ھۈجەيرە ياماق قىسقۇچ خاتىرىلەش ئارقىلىق OXPHOS كەمچىل نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنىڭ پاسسىپ ئېلېكتر خاراكتېرىنى تەھلىل قىلدۇق (2E-رەسىم). كۈتۈلمىگەندە، Mfn2cKO نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنىڭ ئوتتۇرىچە ئارام ئېلىش پەردىسى پوتېنسىيالى ۋە كىرىش قارشىلىقى كونترول گۇرۇپپىسىدىكىگە ئوخشاش بولدى، گەرچە ھۈجەيرىلەر ئارىسىدا ئىنچىكە پەرقلەر بولسىمۇ (1-جەدۋەل). شۇنىڭغا ئوخشاش، 4 ھەپتىدىن 5 ھەپتىگىچە بولغان مەزگىلدە، توك-توك بېسىمى مۇناسىۋىتىدە (IV ئەگرى سىزىقى) مۇھىم ئۆزگىرىشلەر بايقالمىدى (2F-رەسىم). قانداقلا بولمىسۇن، 7 ھەپتىدىن 8 ھەپتىگىچە بولغان Mfn2cKO نېرۋا ھۈجەيرىلىرى IV دا (گىپېرپوليارلىنىش باسقۇچى) ھايات قالمىدى، بۇ بۇ ئاخىرقى باسقۇچتا گىپېرپوليارلىنىش پوتېنسىيالىغا ئېنىق سەزگۈرلۈك بارلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. بۇنىڭغا سېلىشتۇرغاندا، Mfn2cKO نېرۋا ھۈجەيرىلىرىدە، تەكرارلىنىدىغان ھەرىكەت پوتېنسىيالى (AP) قويۇپ بېرىشنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغان قۇتۇپسىزلىنىش ئېقىملىرى ياخشى قوبۇل قىلىنىدۇ، بۇ ئۇلارنىڭ ئومۇمىي قويۇپ بېرىش ئەندىزىسىنىڭ 8 ھەپتىلىك كونترول نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنىڭكىدىن روشەن پەرقلەنمەيدىغانلىقىنى كۆرسىتىدۇ (1-جەدۋەل ۋە 2G-رەسىم). شۇنىڭغا ئوخشاش، ئۆزلۈكىدىن پەيدا بولغان سىناپستىن كېيىنكى ئېقىملارنىڭ (sPSC) چاستوتىسى ۋە ئامپلىتۇدىسى كونترول گۇرۇپپىسىدىكىلەر بىلەن سېلىشتۇرغىلى بولىدۇ، ھەمدە ۋەقەلەرنىڭ چاستوتىسى 4 ھەپتىدىن 5 ھەپتىگىچە، 7 ھەپتىدىن 8 ھەپتىگىچە ئوخشاش ئېشىش بىلەن ئاشتى (2-رەسىم، H ۋە I). PN دىكى سىناپس پىشىپ يېتىلىش مەزگىلى (25). تۆشۈكلۈك PN ياماقلىرىدىن كېيىن ئوخشاش نەتىجىلەر قولغا كەلتۈرۈلدى. بۇ سەپلىمە پۈتۈن ھۈجەيرە ياماق قىسقۇچ خاتىرىلىشىدە يۈز بېرىشى مۇمكىن بولغاندەك، ھۈجەيرە ATP كەمتۈكلۈكلىرىنىڭ مۇمكىن بولغان تولۇقلىنىشىنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ. بولۇپمۇ، Mfn2cKO نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنىڭ دەم ئېلىش پەردىسى پوتېنسىيالى ۋە ئۆزلۈكىدىن قوزغىلىش چاستوتىسى تەسىرگە ئۇچرىمىدى (2-رەسىم، J ۋە K). قىسقىسى، بۇ نەتىجىلەر روشەن OXPHOS ئىقتىدارىنىڭ قالايمىقانلىشىشىغا ئىگە PN لارنىڭ يۇقىرى چاستوتىلىق راۋانلىق ئەندىزىسىگە ياخشى تاقابىل تۇرالايدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ، بۇ ئۇلارنىڭ نورمال ئېلېكتروفىزىئولوگىيىلىك ئىنكاسنى ساقلاپ قېلىشىغا يول قويىدىغان تولۇقلىما مېخانىزمى بارلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
سانلىق مەلۇماتلار ئوتتۇرىچە قىممەت ± SEM (بىر تەرەپلىمە ئۆزگىرىشچانلىق ئانالىزى، Holm-Sidak نىڭ كۆپ خىل سېلىشتۇرۇش سىنىقى؛ *P<0.05) شەكلىدە ئىپادىلىنىدۇ. بىرلىك نومۇرى قاۋۇس ئىچىدە كۆرسىتىلىدۇ.
بىز پروتېئومىكا سانلىق مەلۇمات توپلىمىدىكى (1G-رەسىم) ھەر قانداق بىر تۈرنىڭ ئېغىر OXPHOS كەمچىللىكىگە قارشى تۇرالايدىغان يوللارنى ئۆز ئىچىگە ئالغان-ئالمىغانلىقىنى تەكشۈرۈشكە باشلىدۇق، بۇ ئارقىلىق تەسىرگە ئۇچرىغان PN نىڭ نېمە ئۈچۈن نورمال ئېلېكتروفىزىئولوگىيىلىك ھالىتىنى ساقلىيالايدىغانلىقىنى چۈشەندۈرۈپ بېرىدۇ (2-رەسىم، E دىن K غىچە). پروتېئومىكا ئانالىزى شۇنى كۆرسەتتىكى، تارماق زەنجىرسىمان ئامىنو كىسلاتاسى (BCAA) نىڭ كاتابولىزمىغا قاتناشقان ئېنزىملار كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە ئېشىپ كەتكەن (3A-رەسىم ۋە S5A-رەسىم)، ھەمدە ئاخىرقى مەھسۇلات ئاتسېتىل-CoA (CoA) ياكى سۇكسىنىل CoA ئارتېرىيە قېتىشىش كىسلاتاسى (TCA) دەۋرىيلىكىدىكى ئۈچ كاربونبوكسىلاتلارنى تولۇقلىيالايدۇ. بىز BCAA ترانسئامىنازا 1 (BCAT1) ۋە BCAT2 نىڭ مىقدارىنىڭ ئاشقانلىقىنى بايقىدۇق. ئۇلار α-كېتوگلۇتاراتتىن گلۇتامات ھاسىل قىلىش ئارقىلىق BCAA كاتابولىزمىنىڭ بىرىنچى باسقۇچىنى كاتالىزاتورلايدۇ (26). تارماق زەنجىرلىك كېتو كىسلاتا دېھىدروگېنازا (BCKD) بىرىكمىسىنى تەشكىل قىلىدىغان بارلىق تارماق بىرلىكلەرنىڭ تەڭشىلىشى يۇقىرى كۆتۈرۈلىدۇ (بۇ بىرىكمە ھاسىل بولغان BCAA كاربون ئىسكىلىتىنىڭ كېيىنكى ۋە قايتۇرغىلى بولمايدىغان دېكاربونسىزلىنىشىنى كاتالىزاتورلايدۇ) (3A-رەسىم ۋە S5A-رەسىم). قانداقلا بولمىسۇن، تۈرگە ئايرىلغان PN دا BCAA نىڭ ئۆزىدە روشەن ئۆزگىرىش بايقالمىدى، بۇ ھۈجەيرىلەرنىڭ بۇ مۇھىم ئامىنو كىسلاتالارنى سۈمۈرۈشىنىڭ ئېشىشى ياكى TCA دەۋرىيلىكىنى تولۇقلاش ئۈچۈن باشقا مەنبەلەرنى (گلۇكوزا ياكى سۈت كىسلاتاسى) ئىشلىتىش بىلەن مۇناسىۋەتلىك بولۇشى مۇمكىن (S5B-رەسىم). OXPHOS كەمچىل PN لار 8 ھەپتىلىك ياشتا گلۇتامىن پارچىلىنىش ۋە ترانسئامىناتسىيە پائالىيىتىنىڭ ئاشقانلىقىنى كۆرسەتتى، بۇنى مىتوخوندىرىيە ئېنزىملىرى گلۇتامىنازا (GLS) ۋە گلۇتامىن پىرۇۋات ترانسئامىنازا 2 (GPT2) نىڭ تەڭشىلىشىدىن كۆرۈۋالغىلى بولىدۇ (3-رەسىم، A ۋە C). شۇنىڭغا دىققەت قىلىشقا ئەرزىيدۇكى، GLS نىڭ ئۆرلىشى پەقەت بىرىكمە ئىزوفورم گلۇتامىناز C (GLS-GAC) بىلەنلا چەكلىنىدۇ (Mfn2cKO/CTRL نىڭ ئۆزگىرىشى تەخمىنەن 4.5 ھەسسە، P = 0.05)، ھەمدە ئۇنىڭ راك توقۇلمىلىرىدىكى ئالاھىدە ئۆرلىشى مىتوخوندىرىيە بىئوئېنېرگىيىسىنى قوللايدۇ. (27).
(A) ئىسسىقلىق خەرىتىسى 8 ھەپتىلىك بەلگىلەنگەن يولدا ئاقسىل سەۋىيىسىنىڭ قاتلىنىش ئۆزگىرىشىنى كۆرسىتىدۇ. (B) PCx غا قارشى ئانتىتېلا بىلەن بەلگە قويۇلغان كىچىك مېڭە پارچىسىنىڭ مىسالى (مىقياسلىق بالداق، 20 μm). سېرىق ئوق پۇركىنجې ھۈجەيرە تېنىگە قارىتىلغان. (C) ئاتروسېكلورىزمنىڭ مۇھىم كاندىداتى دەپ بېكىتىلگەن ۋاقىت جەريانىدىكى ئاقسىل ئىپادىلەش ئانالىزى (كۆپ t-سىناق، *FDR <5%; n = 3-5 چاشقان). (D) ئۈستى: [1-13C]پىراۋات ئىز قوغلىغۇچتا بار بولغان بەلگە قويۇلغان كاربوننىڭ كىرىشىنىڭ ھەر خىل ئۇسۇللىرىنى كۆرسىتىدىغان سىخېماتىك دىئاگرامما (يەنى، PDH ياكى ئارتېرىيە يولى ئارقىلىق). ئاستى: سىكرىپكا دىئاگراممىسى ئۆتكۈر كىچىك مېڭە پارچىلىرىنى [1-13C]پىراۋات بىلەن بەلگە قويغاندىن كېيىن، يەككە بەلگە قويۇلغان كاربوننىڭ (M1) ئاسپارتىك كىسلاتا، لىمون كىسلاتاسى ۋە ئالما كىسلاتاسىغا ئايلانغان نىسبىتىنى كۆرسىتىدۇ (جۈپ t-سىناق؛ ** P <0.01). (E) كۆرسىتىلگەن يولنىڭ ئومۇميۈزلۈك ۋاقىت تارىخى ئانالىزى. پەقەت 8 ھەپتىدە P<0.05 بولغان ئاقسىللارنىلا كۆزدە تۇتۇڭ. ئۈزۈك سىزىق: تەڭشەش قىممىتى يوق (ئىككى تەرەپلىك ئۆزگىرىشچانلىق ئانالىزى؛ * P <0.05؛ *** P <0.001). سانلىق مەلۇماتلار ئوتتۇرىچە ± SEM شەكلىدە ئىپادىلىنىدۇ.
بىزنىڭ تەھلىلىمىزدە، BCAA كاتابولىزمى مۇھىم ئۆرلەش يوللىرىنىڭ بىرىگە ئايلاندى. بۇ پاكىت OXPHOS بولمىغان PN دا TCA دەۋرىگە كىرىدىغان شامالدۇرۇلۇش مىقدارىنىڭ ئۆزگىرىشى مۇمكىنلىكىنى كۈچلۈك كۆرسىتىپ بېرىدۇ. بۇ نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنىڭ ماددا ئالمىشىش قايتا ئۇلىنىشىنىڭ ئاساسلىق شەكلى بولۇشى مۇمكىن، بۇ ئېغىر OXPHOS ئىقتىدارىنىڭ قالايمىقانلىشىشىنى ساقلاش جەريانىدا نېرۋا فىزىئولوگىيىسى ۋە ياشاش ئىقتىدارىغا بىۋاسىتە تەسىر كۆرسىتىشى مۇمكىن. بۇ پەرەزگە ماس ھالدا، بىز ئاساسلىق ئاتتېروسكلېروزغا قارشى ئېنزىم PCx نىڭ ئۆرلەۋاتقانلىقىنى بايقىدۇق (Mfn2cKO/CTRL تەخمىنەن 1.5 قېتىم ئۆزگىرىدۇ؛ 3A-رەسىم)، بۇ پىرۇۋاتنىڭ ئوكسالوئاتسېتاتقا ئايلىنىشىنى كاتالىزاتورلايدۇ (28)، بۇ مېڭە توقۇلمىسىدا بولىدۇ دەپ قارىلىدۇ. نىڭ ئىپادىسى پەقەت ئاستروسىتلار بىلەنلا چەكلىنىدۇ (29، 30). پروتېئومىكا نەتىجىلىرىگە ماس ھالدا، كونفوكال مىكروسكوپ PCx ئىپادىسىنىڭ OXPHOS كەمچىل PN لاردا ئالاھىدە ۋە كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە ئاشقانلىقىنى، PCx نىڭ رېئاكتىپلىقىنىڭ بولسا ئاساسلىقى كونترول گۇرۇپپىسىدىكى قوشنا بېرگمان گلىيا ھۈجەيرىلىرى بىلەنلا چەكلىنىدىغانلىقىنى كۆرسەتتى (3B-رەسىم). PCx نىڭ كۆزىتىلگەن ئۆرلەش دەرىجىسىنى فۇنكسىيەلىك جەھەتتىن سىناق قىلىش ئۈچۈن، بىز ئۆتكۈر كىچىك مېڭە پارچىلىرىنى [1-13C]پىراۋات ئىز قوغلىغۇچ بىلەن داۋالىدۇق. پىراۋات پىرۇۋات دېھىدروگېنازا (PDH) تەرىپىدىن ئوكسىدلانغاندا، ئۇنىڭ ئىزوتوپ بەلگىسى يوقاپ كەتتى، لېكىن پىراۋات قان تومۇر رېئاكسىيەسى ئارقىلىق مېتابولىزملانغاندا TCA دەۋرىيلىك ئارىلىق مەھسۇلاتلىرىغا قوشۇلىدۇ (3D-رەسىم). پروتېئومىكا سانلىق مەلۇماتلىرىمىزنى قوللاش ئۈچۈن، بىز Mfn2cKO پارچىلىرىنىڭ ئاسپارتىك كىسلاتاسىدا بۇ ئىز قوغلىغۇچتىن نۇرغۇن بەلگىلەرنى كۆزەتتۇق، لىمون كىسلاتاسى ۋە ئالما كىسلاتاسىمۇ ئوتتۇراھال يۈزلىنىشكە ئىگە، گەرچە مۇھىم بولمىسىمۇ (3D-رەسىم).
مىتوپارك چاشقانلىرىنىڭ دوپامىن نېرۋا ھۈجەيرىلىرى مىتوخوندىرىيە ترانسكرىپسىيە ئامىلى A گېنىنى (Tfam) مەخسۇس ۋەيران قىلىش سەۋەبىدىن مىتوخوندىرىيە ئىقتىدارىنىڭ قالايمىقانلىشىشىغا گىرىپتار بولغان دوپامىن نېرۋا ھۈجەيرىلىرىدە (S6B-رەسىم)، PCx ئىپادىسىمۇ كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە ئاشقان (31)، بۇ ئاتسېتون كىسلاتالىق ئارتېرىيە قېتىشىش كېسىلىنىڭ يۈز بېرىشى بەدەندىكى نېرۋا ھۈجەيرىلىرى OXPHOS ئىقتىدارىنىڭ قالايمىقانلىشىشى جەريانىدا تەڭشىلىنىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. شۇنى ئالاھىدە تەكىتلەپ ئۆتۈشكە ئەرزىيدۇكى، ئارتېرىيە قېتىشىش بىلەن مۇناسىۋەتلىك بولۇشى مۇمكىن بولغان نېرۋا ھۈجەيرىلىرىدە ئىپادىلىنىشى مۇمكىن بولغان ئۆزگىچە ئېنزىملار (32-34) OXPHOS كەمچىل بولغان PN لاردا، مەسىلەن پروپىئونىل-CoA كاربونسىلازا (PCC-A)، مالونىل-CoA پروپىئونىل-CoA نى سۇكسىنىل-CoA غا ئايلاندۇرىدىغان ۋە ئاساسلىق رولى پىرۇۋاتنى مالاتتىن قايتۇرۇۋېلىش بولغان مىتوخوندىرىيە ئالما ئېنزىم 3 (ME3) دا كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە ئاشقان (3-رەسىم، A ۋە C-رەسىم) (33، 35). بۇنىڭدىن باشقا، بىز Pdk3 ئېنزىمىنىڭ كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە ئاشقانلىقىنى بايقىدۇق، بۇ ئېنزىم PDH نى فوسفورلايدۇ ۋە شۇنىڭ بىلەن ئاكتىپسىزلاندۇرىدۇ (36)، PDH نى ئاكتىپلاشتۇرىدىغان Pdp1 ئېنزىمىدا ياكى PDH ئېنزىم بىرىكمىسىنىڭ ئۆزىدە ھېچقانداق ئۆزگىرىش بايقالمىغان (3A-رەسىم). Mern2cKO PN لاردا، Ser293 دىكى PDH بىرىكمىسىنىڭ پىرۇۋات دېھىدروگېنازا E1 تەركىبىي قىسمىنىڭ α1 تارماق بىرلىكى α (PDHE1α) تارماق بىرلىكىنىڭ فوسفورلىنىشى (PDH نىڭ ئېنزىم پائالىيىتىنى چەكلەيدىغانلىقى مەلۇم) كۈچەيگەن (S6C-رەسىم) (S6C-رەسىم). پىرۇۋاتنىڭ قان تومۇرغا كىرىش يولى يوق.
ئاخىرىدا، بىز دوكلاتلارغا قارىغاندا، سېرىن ۋە گلىتسىن بىئوسىنتېزىنىڭ يۇقىرى يولى، مۇناسىۋەتلىك مىتوخوندىرىيە فولات (1C) دەۋرى ۋە پرولىن بىئوسىنتېزى (1G-رەسىم ۋە S5C-رەسىم) نىڭ ھەممىسى ئاكتىپلاشتۇرۇش جەريانىدا كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە يۇقىرى كۆتۈرۈلىدىغانلىقىنى بايقىدۇق. ئەتراپتىكى توقۇلمىلار مىتوخوندىرىيە ئىقتىدارىنىڭ قالايمىقانلىشىشى بىلەن ئاكتىپلىنىدۇ (5-7). بۇ پروتېئومىكا سانلىق مەلۇماتلىرىنى قوللايدىغان كونفوكال ئانالىزى شۇنى كۆرسەتتىكى، OXPHOS يوق PN دا، 8 ھەپتىلىك چاشقانلارنىڭ كىچىك مېڭە پارچىلىرى مىتوخوندىرىيە فولات دەۋرىنىڭ ئاچقۇچلۇق ئېنزىم بولغان سېرىن گىدروكسىمېتىلترانسفېرازا 2 (SHMT2) غا ئۇچرىغان. بۇ كۆرۈنەرلىك ئىممۇنىتېت ئىنكاسى (S5D-رەسىم). 13 CU-گلىۋكوزا بىلەن ئىنكۇباتسىيە قىلىنغان ئۆتكۈر كىچىك مېڭە پارچىلىرىدا، ماددا ئالمىشىش ئىز قوغلاش تەجرىبىلىرى سېرىن ۋە پرولىن بىئوسىنتېزىنىڭ يۇقىرى كۆتۈرۈلگەنلىكىنى تېخىمۇ جەزملەشتۈردى، بۇ كاربون ئىزوفورمىلىرىنىڭ سېرىن ۋە پرولىنغا ئايلىنىشىنىڭ ئاشقانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ (S5E-رەسىم). GLS ۋە GPT2 تەرىپىدىن ئىلگىرى سۈرۈلىدىغان رېئاكسىيەلەر گلۇتامىندىن گلۇتاماتنىڭ سىنتېزى ۋە گلۇتامات بىلەن α-كېتوگلۇتارات ئوتتۇرىسىدىكى ترانسمىناتسىيەگە مەسئۇل بولغاچقا، ئۇلارنىڭ يۇقىرىلىشى OXPHOS كەمچىل نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنىڭ گلۇتاماتقا بولغان ئېھتىياجىنىڭ ئاشقانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. بۇ پرولىننىڭ بىئوسىنتېزىنىڭ ئېشىشىنى ساقلاشنى مەقسەت قىلغان بولۇشى مۇمكىن (S5C-رەسىم). بۇ ئۆزگىرىشلەردىن پەرقلىق ھالدا، PN غا خاس Mfn2cKO چاشقانلىرىدىن ئېلىنغان كىچىك مېڭە ئاستروسىتلىرىنىڭ پروتېئومىك ئانالىزى بۇ يوللارنىڭ (بارلىق ئانتىپېروكسىدازا فېرمېنتلىرىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ) ئىپادىلىنىشىدە كۆرۈنەرلىك ئۆزگىرىش بولمىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بەردى، بۇ ماددا ئالمىشىش يۆنىلىشىنىڭ پارچىلانغان PN غا تاللاپ يۆتكىلىشى ئىكەنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ (S6-رەسىم، D دىن G غىچە).
خۇلاسە قىلىپ ئېيتقاندا، بۇ تەھلىللەر PN دىكى ئالاھىدە ماددا ئالمىشىش يوللىرىنىڭ ۋاقىت جەھەتتىن ئاكتىپلىنىشىنىڭ كۆرۈنەرلىك پەرقلىق ئەندىزىلىرىنى ئاشكارىلىدى. نېرۋا مىتوخوندىرىيەسىنىڭ نورمالسىز فۇنكسىيەسى بالدۇر ئاتلېروز ۋە 1C قايتا شەكىللىنىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىشى مۇمكىن (3E-رەسىم ۋە S5C-رەسىم)، ھەتتا I ۋە IV مۇرەككەپ ماددىلىرىنىڭ ئىپادىلىنىشىدىكى مۆلچەرلىگىلى بولىدىغان ئۆزگىرىشلەرنى كەلتۈرۈپ چىقىرىشى مۇمكىن بولسىمۇ، يېڭى سېرىن سىنتېزىدىكى ئۆزگىرىشلەر پەقەت ئاخىرقى باسقۇچلاردالا روشەن بولدى. OXPHOS ئىقتىدارىنىڭ قالايمىقانلىشىشى (3E-رەسىم ۋە S5C-رەسىم). بۇ بايقاشلار بېسىم كەلتۈرۈپ چىقارغان مىتوخوندىرىيە (1C دەۋرىيلىكى) ۋە سىتوپلازما (سېرىن بىئوسىنتېزى) نىڭ TCA دەۋرىيلىكىدىكى ئاتلېروزنىڭ ئېشىشى بىلەن بىرلىكتە نېرۋا ماددا ئالمىشىشىنى قايتا شەكىللەندۈرۈش ئۈچۈن بىر-بىرىگە ماس كېلىدىغان بىر تەرتىپلىك جەرياننى بەلگىلەيدۇ.
8 ھەپتىلىك OXPHOS كەمچىل PN لار يۇقىرى چاستوتىلىق قوزغىتىش پائالىيىتىنى ساقلاپ قالالايدۇ ۋە مىتوخوندىرىيە ئىقتىدارىنىڭ قالايمىقانلىشىشىنى تولۇقلاش ئۈچۈن مۇھىم ماددا ئالمىشىش قايتا ئۇلىنىشىغا ئېرىشەلەيدۇ. بۇ بايقاش قىزىقارلىق ئېھتىماللىقنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ، ھەتتا بۇ ھۈجەيرىلەر نېرۋا چېكىنىشىنى كېچىكتۈرۈش ياكى ئالدىنى ئېلىش ئۈچۈن داۋالاش ئارىلىشىشىنى قوبۇل قىلىشى مۇمكىن. كېچىكىپ قالغان. بىز بۇ ئېھتىماللىقنى ئىككى مۇستەقىل ئارىلىشىش ئارقىلىق ھەل قىلدۇق. بىرىنچى ئۇسۇلدا، بىز Cre غا تايىنىدىغان ئادېنو بىلەن مۇناسىۋەتلىك ۋىرۇس (AAV) ۋېكتورىنى لايىھىلىدۇق، شۇنداق قىلىپ MFN2 نى تىرىك جانلىقلاردا OXPHOS كەمچىل PN لاردا تاللاپ ئىپادىلىگىلى بولىدۇ (S7A-رەسىم). MFN2 نى كودلايدىغان AAV ۋە فلۇئورېسسېنتلىق خەۋەرچى گېنى mCherry (Mfn2-AAV) سىناق نەيچىسىدىكى دەسلەپكى نېرۋا ھۈجەيرىسى مەدەنىيىتىدە تەكشۈرۈلدى، بۇ MFN2 نىڭ Cre غا تايىنىدىغان ئۇسۇلدا ئىپادىلىنىشىنى كەلتۈرۈپ چىقاردى ۋە مىتوخوندىرىيە مورفولوگىيەسىنى قۇتقۇزدى، شۇنىڭ بىلەن Mfn2cKO نېرۋا ھۈجەيرىلىرىدىكى نېرۋا مۇتاتسىيەسىنىڭ ئالدىنى ئالدى (S7، B، D ۋە E-رەسىم). ئاندىن، بىز 8 ھەپتىلىك Mfn2-AAV نى Mfn2cKO ۋە كونترول چاشقانلىرىنىڭ مېڭە پوستلۇقىغا ستېرېئوتېكتىك يەتكۈزۈش ئۈچۈن تىرىك جانلىقلار تەجرىبىسى ئېلىپ باردۇق ۋە 12 ھەپتىلىك چاشقانلارنى تەھلىل قىلدۇق (4A-رەسىم). داۋالانغان Mfn2cKO چاشقانلىرى ئۆلۈپ كەتتى (1-رەسىم، A ۋە B) (16). تىرىك جانلىقلاردا ۋىرۇسنىڭ يۆتكىلىشى بەزى مېڭە چەمبەرلىرىدە PN نىڭ تاللاپ ئىپادىلىنىشىنى كەلتۈرۈپ چىقاردى (S7-رەسىم، G ۋە H). پەقەت mCherry نى ئىپادىلەيدىغان كونترول AAV نىڭ (Ctrl-AAV) ئوكۇل قىلىنىشى Mfn2cKO ھايۋانلىرىنىڭ نېرۋا چېكىنىش دەرىجىسىگە ھېچقانداق مۇھىم تەسىر كۆرسەتمىدى. ئەكسىچە، Mfn2-AAV بىلەن يۆتكىلىدىغان Mfn2cKO لارنىڭ ئانالىزى PN ھۈجەيرە قەۋىتىنىڭ مۇھىم قوغداش رولىنى كۆرسەتتى (4-رەسىم، B ۋە C). بولۇپمۇ، نېرۋا ھۈجەيرىسىنىڭ زىچلىقى كونترول ھايۋانلىرىدىن ئاساسەن پەرقلەنمەيدىغاندەك قىلىدۇ (4-رەسىم، B ۋە C، ۋە S7-رەسىم، H ۋە I). MFN1 نىڭ ئىپادىلىنىشى، MFN2 نىڭ ئىپادىلىنىشى ئەمەس، بەلكى نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنىڭ ئۆلۈمىنى قۇتقۇزۇشتا ئوخشاشلا ئۈنۈملۈك (4C-رەسىم ۋە S7، C ۋە F-رەسىملەر)، بۇ ئېكتوپىك MFN1 نىڭ ئىپادىلىنىشىنىڭ MFN2 نىڭ كەمچىللىكىنى ئۈنۈملۈك تولۇقلىيالايدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. يەككە PN سەۋىيەسىدىكى تېخىمۇ چوڭقۇر تەھلىللەردە، Mfn2-AAV نىڭ مىتوخوندىرىيەنىڭ ئۇلترا قۇرۇلمىسىنى ئاساسەن قۇتقۇزغانلىقى، mtDNA سەۋىيەسىنى نورماللاشتۇرغانلىقى ۋە ئانتىئانگېنېز بەلگىسى PCx نىڭ يۇقىرى ئىپادىلىنىشىنى ئۆزگەرتكەنلىكى كۆرسىتىلدى (4-رەسىم، C دىن E گىچە). قۇتقۇزۇۋېلىنغان Mfn2cKO چاشقانلىرىنى دەم ئېلىش ھالىتىدە كۆز بىلەن تەكشۈرۈشتە، ئۇلارنىڭ ھالىتى ۋە ھەرىكەت ئالامەتلىرى (S1 دىن S3 گىچە ھەرىكەت) ياخشىلانغانلىقى كۆرسىتىلدى. خۇلاسە قىلىپ ئېيتقاندا، بۇ تەجرىبىلەر شۇنى كۆرسىتىپ بېرىدۇكى، OXPHOS ئېغىر دەرىجىدە كەمچىل بولغان PN لارغا MFN2 نى كېچىكتۈرۈپ قايتا كىرگۈزۈش mtDNA ئىستېمالىنى ئۆزگەرتىش ۋە ئارتېرىيە قېتىشىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىشقا يېتەرلىك بولۇپ، شۇ ئارقىلىق ئاكسون چېكىنىشى ۋە نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنىڭ ئۆلۈشىنىڭ ئالدىنى ئېلىش ئۈچۈن تىرىك جانلىقلاردا يېتەرلىك.
(A) كۆرسىتىلگەن ماددا ئالمىشىش يولى ئاكتىپلانغاندا MFN2 نى كودلايدىغان AAV نى ئوكۇل قىلىش تەجرىبە جەدۋىلىنى كۆرسىتىدىغان بىر سىخېما. (B) 8 ھەپتىلىك Mfn2cKO چاشقانلىرىدا ئايلاندۇرۇلغان ۋە كالبىندىنغا قارشى ئانتىتېلا بىلەن بەلگە قويۇلغان 12 ھەپتىلىك كىچىك مېڭە پارچىلىرىنىڭ ۋەكىللىك كونفوكال رەسىملىرى. ئوڭ تەرەپ: ئاكسون تالالىرىنىڭ چوڭايتىلىشى. ئاكسون چوڭايتىش كۆلىمى 450 ۋە 75 μm. (C) سول تەرەپ: AAV ئايلاندۇرۇش ھالقىسىدىكى (AAV+) پۇركىنجې ھۈجەيرىسى زىچلىقىنىڭ مىقدارلاشتۇرۇلۇشى (بىر تەرەپلىمە ئۆزگىرىشچانلىق ئانالىزى؛ n = 3 چاشقان). ئوڭ تەرەپ: 12-ھەپتىدە ئايلاندۇرۇلغان PN دىكى mtDNA مەركەز ئانالىزى (جۈپلەشمىگەن t-سىناق؛ n = ئۈچ چاشقاندىن ئېلىنغان 6 ھۈجەيرە). * P <0.05; ** P <0.01. (D) كۆرسىتىلگەن ۋىرۇس ۋېكتورلىرى بىلەن ئايلاندۇرۇلغان Mfn2cKO كىچىك مېڭە پارچىلىرىنىڭ PN لىرىنىڭ ۋەكىللىك يەتكۈزۈش ئېلېكترون مىكروگرافىيەلىرى. ھالرەڭ ماسكا دېندرىتلار ئىگىلىگەن بوشلۇقنى، سېرىق نۇقتىلىق كۋادرات ئوڭ تەرەپتىكى چوڭايتىشنى كۆرسىتىدۇ؛ n يادرونى كۆرسىتىدۇ. كۆلەم بالداق، 1μm. (E) 12 ھەپتىدە PN دا PCx رەڭلىنىشىنىڭ مىسالىنى كۆرسىتىدۇ. كۆلەم بالداق، 20μm. OE، ئارتۇق ئىپادىلەش؛ FC، قاتلىنىش ئۆزگىرىشى.
ئاخىرىدا، بىز OXPHOS ئىقتىدارىنىڭ قالايمىقانلىشىشىغا ئۇچرىغان PN لاردا پېروكسىدازا قوزغىغان ھۈجەيرىلەرنىڭ ياشاش نىسبىتىنىڭ مۇھىملىقىنى تەكشۈردۇق. بىز چاشقان PCx mRNA (AAV-shPCx) نى نىشان قىلغان AAV-shRNA (قىسقا تۈكلۈك RNA) نى كودلايدىغان mCherry نى ھاسىل قىلدۇق ۋە ۋىرۇسنى ياكى ئۇنىڭ ئارىلاشتۇرۇلغان كونترول ھۈجەيرىسىنى (AAV-scr) Mfn2cKO چاشقانلىرىنىڭ كىچىك مېڭە قىسمىغا ئوكۇل قىلدۇق. بۇ ئوكۇل تۆتىنچى ھەپتىلىك ياشتا ئېلىپ بېرىلدى (5A-رەسىم)، PCx ئىپادىسى ئاشقان مەزگىلدە (3C-رەسىم) ۋە PN ھۈجەيرە قەۋىتى يەنىلا ساقلانغان مەزگىلدە (1A-رەسىم) ئۈنۈملۈك PCx نى يوقىتىشقا ئېرىشتى. شۇنى ئەسكەرتىش كېرەككى، PCx نى يوقىتىش (S8A-رەسىم) PN نىڭ ئۆلۈشىنى كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە تېزلىتىدۇ، بۇ يۇقۇملانغان ھالقىسى بىلەنلا چەكلىنىدۇ (5-رەسىم، B ۋە C-رەسىم). PCx نىڭ ئۆرلەش تەڭشىلىشى كەلتۈرۈپ چىقارغان ماددا ئالمىشىش ئۈنۈمىنىڭ مېخانىزمىنى چۈشىنىش ئۈچۈن، بىز PCx نىڭ نوكداۋنى ۋە AAV ئارقىلىق ئوپتىكىلىق بىئوسېنسور Grx1-roGFP2 بىرلا ۋاقىتتا ئىپادىلەنگەندىن كېيىنكى PN لارنىڭ ئوكسىدلىنىش-قايتالىنىش ھالىتىنى تەتقىق قىلدۇق (S8-رەسىم، B دىن D گىچە)، گلۇتاتىئوننى باھالىدۇق. پېپتىد ئوكسىدلىنىش-قايتالىنىش پوتېنسىيالىنىڭ نىسبىي ئۆزگىرىشى (38). ئاندىن، بىز FLIM شارائىتىنى تەكشۈرگەندىن كېيىن سىتوپلازما ئوكسىدلىنىش-قايتالىنىش ھالىتىدىكى يوشۇرۇن ئۆزگىرىشلەرنى بايقاش ئۈچۈن، 7 ھەپتىلىك Mfn2cKO ياكى كونترول ھۈجەيرىلىرىنىڭ ئۆتكۈر مېڭە پارچىلىرىدا ئىككى فوتونلۇق فلۇئورېسسېنسىيە ئۆمۈرلۈك رەسىم مىكروسكوپى (FLIM) ئېلىپ باردۇق (S8-رەسىم، E دىن G گىچە). ئانالىز PCx ئىپادىسى يوق يەككە Mfn2cKO PN نىڭ ئوكسىدلىنىش ھالىتىنىڭ كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە ئاشقانلىقىنى كۆرسەتتى، بۇ پەقەت ئارىلاشتۇرۇلغان shRNA نى ئىپادىلەيدىغان كونترول نېرونلىرى ياكى Mfn2cKO PN لاردىن پەرقلىنىدۇ (5-رەسىم، D ۋە E). PCx ئىپادىسى تۆۋەنلىگەندە، يۇقىرى ئوكسىدلىنىش ھالىتىنى كۆرسىتىدىغان Mfn2cKO PN لارنىڭ نىسبىتى ئۈچ ھەسسىدىن ئارتۇق ئاشتى (5E-رەسىم)، بۇ PCx نىڭ يۇقىرى تەڭشىلىشى چېكىنىشلىك نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنىڭ ئوكسىدلىنىش-قايتا ئۇرۇش ئىقتىدارىنى ساقلاپ قالغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
(A) كۆرسىتىلگەن ماددا ئالمىشىش يولى ئاكتىپلانغاندا AAV كودلىغۇچى shPCx نى ئوكۇل قىلىش تەجرىبە جەدۋىلىنى كۆرسىتىدىغان بىر سىخېما. (B) 4 ھەپتىدە كالتسىينېۋرىنغا قارشى ئانتىتېلا بىلەن ئالماشتۇرۇلغان ۋە بەلگە قويۇلغان Mfn2cKO چاشقانلىرىنىڭ 8 ھەپتىلىك كىچىك مېڭە كېسىشمىلىرىنىڭ ۋەكىللىك كونفوكال سۈرەتلىرى. كۆلەم بالداق، 450μm. (C) AAV ئالماشتۇرۇلغان ھالقىلاردىكى پۇركىنجې ھۈجەيرىسى زىچلىقىنىڭ مىقدارلاشتۇرۇلۇشى (بىر تەرەپلىمە ئۆزگىرىشچانلىق ئانالىزى؛ n = 3 دىن 4 گىچە چاشقان). سانلىق مەلۇماتلار ئوتتۇرىچە ± SEM شەكلىدە ئىپادىلىنىدۇ؛ ***P<0.001. (D) ۋەكىللىك FLIM رەسىمى بەلگىلەنگەن تەجرىبە شارائىتىدا 7 ھەپتىلىك PN نىڭ گلۇتاتىئون ئوكسىدلىنىش-قايتالىنىش سېنزورى Grx1-roGFP2 نىڭ ئوتتۇرىچە ئۆمرىنى كۆرسىتىدۇ. LUT (ئىزدەش جەدۋىلى) نىسبىتى: ياشاش ۋاقتى ئارىلىقى (پىكوسېكۇنت بىلەن). كۆلەم بالداق، 25μm. (E) گىستوگرامما (D) دىكى Grx1-roGFP2 ئۆمۈر قىممىتىنىڭ تەقسىملىنىشىنى كۆرسىتىدۇ (ھەر بىر شەرت ئاستىدا ئىككى چاشقاننىڭ n=158 دىن 368 گىچە ھۈجەيرىسى). ھەر بىر گىستوگراممىنىڭ ئۈستىدىكى تور شەكىللىك دىئاگرامما: ئۆمرى ئۇزۇنراق (قىزىل، ئوكسىدلانغان) ياكى قىسقا (كۆك، قىسقارتىلغان) بولغان، CTRL-AAV-scr دىكى ئوتتۇرىچە ئۆمۈر قىممىتىنىڭ 1 SD دىن ئېشىپ كەتكەن ھۈجەيرىلەرنىڭ سانىنى كۆرسىتىدۇ. (F) تەكلىپ قىلىنغان مودېل نېرۋا ھۈجەيرىسى PCx نىڭ ئۆرلىشىنىڭ قوغداش رولىنى كۆرسىتىدۇ.
ئومۇمەن قىلىپ ئېيتقاندا، بىز بۇ يەردە تەمىنلىگەن سانلىق مەلۇماتلار MFN2 نىڭ قايتا ئىپادىلىنىشىنىڭ ئېغىر OXPHOS كەمچىللىكى، ئېغىر mtDNA ئازىيىشى ۋە ئىنتايىن نورمالسىز ئىستاغا ئوخشاش مورفولوگىيەسى بار ئىلغار PN نى تولۇق قۇتقۇزالايدىغانلىقىنى، شۇڭا ئېغىر كېسەللىكلەردىمۇ ئۈزلۈكسىز ئىلگىرىلەشنى تەمىنلىيەلەيدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. نېرۋا چېكىنىشى ھۈجەيرە ئۆلۈشتىن بۇرۇنقى باسقۇچنىڭ ئەسلىگە كېلىدىغان دەلىلىنى تەمىنلەيدۇ. بۇ دەرىجىدىكى ماددا ئالمىشىش ئەۋرىشىمچانلىقى نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنىڭ ئاتروكېسلورىزمنى (TCA دەۋرىيلىكىنىڭ قايتا ئۇلىنىشىنى) پەيدا قىلىش ئىقتىدارى بىلەن تېخىمۇ گەۋدىلىنىدۇ، بۇ OXPHOS كەمچىل PN لاردا PCx ئىپادىسىنى چەكلەيدۇ ۋە ھۈجەيرە ئۆلۈشىنى كۈچەيتىدۇ، شۇنىڭ بىلەن قوغداش رولىنى ئوينايدۇ (5F-رەسىم).
بۇ تەتقىقاتتا، بىز PN نىڭ OXPHOS ئىقتىدارىنىڭ قالايمىقانلىشىشىغا بولغان ئىنكاسىنىڭ ماددا ئالمىشىش پروگراممىلىرى تەرىپىدىن قوزغىتىلغان پەرقلىق ئاكتىپلىنىش يولى ئارقىلىق ئاستا-ئاستا TCA دەۋرىيلىك ئاتلېروسېكلورىزىسىغا يېقىنلىشىدىغانلىقىغا دائىر دەلىللەرنى تەمىنلىدۇق. بىز پروتېئومىك ئانالىزنى نۇرغۇن تولۇقلىما ئۇسۇللار بىلەن جەزملەشتۈردۇق ۋە ئېغىر مىتوخوندىرىيە ئىقتىدارىنىڭ قالايمىقانلىشىشىغا دۇچ كەلگەندە، نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنىڭ ئىلگىرى نامەلۇم بولغان ماددا ئالمىشىش ئېلاستىكىلىقىغا ئىگە ئىكەنلىكىنى ئاشكارىلىدۇق. بىزنى ھەيران قالدۇرغىنى شۇكى، پۈتكۈل قايتا سىملاش جەريانى چوقۇم نېرۋا ھۈجەيرىسىنىڭ چېكىنىشىگە ئاستا-ئاستا ۋە قايتۇرغۇسىز ھالدا ھەمراھ بولىدىغان ئاخىرقى ماددا ئالمىشىش ھالىتىنى بەلگىلىمەيدۇ، ئەمما بىزنىڭ سانلىق مەلۇماتلىرىمىز ئۇنىڭ ھۈجەيرە ئۆلۈشتىن بۇرۇنقى باسقۇچتا بولسىمۇ بىر ساقلاش نېرۋا ھۈجەيرىسى بولۇشى مۇمكىنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. فۇنكسىيەلىك تولۇقلىما مېخانىزمى. بۇ بايقاش نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنىڭ بەدەندە ماددا ئالمىشىش ئېلاستىكىلىقىنىڭ كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە بارلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. بۇ پاكىت MFN2 نىڭ كېيىن قايتا كىرگۈزۈلۈشىنىڭ ئاساسلىق ماددا ئالمىشىش بەلگىلىرىنىڭ ئىپادىسىنى ئۆزگەرتەلەيدىغانلىقىنى ۋە PN نىڭ چېكىنىشىنىڭ ئالدىنى ئالالايدىغانلىقىنى ئىسپاتلايدۇ. ئەكسىچە، ئۇ ئاتلېروسېكلورىزنى توسىدۇ ۋە نېرۋىلارنى تېزلىتىدۇ. جىنىسلىق ترانسگېندېراتسىيە.
تەتقىقاتىمىزدىكى ئەڭ قىزىقارلىق بايقاشلارنىڭ بىرى شۇكى، OXPHOS كەمچىل PN لار ئارتېرىيە قېتىشىشنى قوزغىتىدىغان ئېنزىملارنى ئاشۇرۇش ئارقىلىق TCA دەۋرىيلىك ماددا ئالمىشىشىنى ئۆزگەرتەلەيدۇ. ماددا ئالمىشىش قايتا تەشكىللىنىشى راك ھۈجەيرىلىرىنىڭ ئورتاق ئالاھىدىلىكى بولۇپ، ئۇلارنىڭ بەزىلىرى نەپەسلىنىش زەنجىرىنى قوزغىتىدىغان ۋە ماي ​​ۋە نۇكلېئوتىد بىئوسىنتېزىنىڭ ئالدىنقى ماددىلىرىنىڭ ئىشلەپچىقىرىلىشىنى ساقلايدىغان TCA دەۋرىيلىك ئارىلىق ماددىلارنى تولۇقلاش ئۈچۈن گلۇتامىنغا تايىنىدۇ (39، 40). يېقىنقى بىر تەتقىقاتتا، OXPHOS ئىقتىدارىنىڭ قالايمىقانلىشىشىنى باشتىن كەچۈرۈۋاتقان يان توقۇلمىلاردا، گلۇتامىن/گلۇتامات ماددا ئالمىشىشىنىڭ قايتا ئۇلىنىشىمۇ مۇھىم بىر ئالاھىدىلىك ئىكەنلىكى كۆرسىتىلدى (5، 41)، بۇ يەردە گلۇتامىننىڭ TCA دەۋرىيلىكىگە كىرىش يۆنىلىشى OXPHOS يارىلىنىشىنىڭ ئېغىرلىق دەرىجىسىگە باغلىق (41). قانداقلا بولمىسۇن، بەدەندىكى نېرۋا ماددا ئالمىشىش پىلاستىكىلىقىنىڭ ئوخشاشلىقى ۋە ئۇنىڭ كېسەللىك ئەھۋالىدىكى مۇمكىن بولغان مۇناسىۋىتى توغرىسىدا ئېنىق دەلىل يوق. يېقىنقى بىر سىناق تەجرىبە تەتقىقاتىدا، ئاساسلىق قاپاق نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنىڭ نېرۋا ئۆتكۈزۈش ئۈچۈن گلۇتامات كۆلچىكىنى سەپەرۋەر قىلىدىغانلىقى، شۇنىڭ بىلەن ماددا ئالمىشىش بېسىمى ئاستىدا ئوكسىدلىنىش ماددا ئالمىشىشى ۋە ئاتسېروسېكلورىزمنى ئىلگىرى سۈرىدىغانلىقى كۆرسىتىلدى (42). شۇنىڭغا دىققەت قىلىشقا ئەرزىيدۇكى، TCA دەۋرىيلىك ئېنزىم سۇكسىنات دېھىدروگېنازانىڭ فارماكولوگىيىلىك چەكلىنىشى ئاستىدا، پىرۇۋات كاربونلىشىشىنىڭ يېتىشتۈرۈلگەن كىچىك مېڭە دانچىسى نېرۋا ھۈجەيرىلىرىدە ئوكسالوئاتسېتاتنىڭ سىنتېزىنى ساقلايدىغانلىقىغا ئىشىنىلىدۇ (34). قانداقلا بولمىسۇن، بۇ مېخانىزملارنىڭ مېڭە توقۇلمىلىرىغا بولغان فىزىئولوگىيىلىك مۇناسىۋىتى (ئاتروسېكلورىزمنىڭ ئاساسلىقى ئاستروسىتلار بىلەنلا چەكلىنىدىغانلىقىغا ئىشىنىلىدۇ) يەنىلا مۇھىم فىزىئولوگىيىلىك ئەھمىيەتكە ئىگە (43). بۇ ئەھۋالدا، بىزنىڭ سانلىق مەلۇماتلىرىمىز شۇنى كۆرسىتىپ بېرىدۇكى، بەدەندە OXPHOS تەرىپىدىن بۇزۇلغان PN لار BCAA پارچىلىنىشى ۋە پىرۇۋات كاربونلىشىشىغا ئالماشتۇرۇلىدۇ، بۇلار TCA كۆلچىكى ئارىلىق مەھسۇلاتلىرىنى تولۇقلاشنىڭ ئىككى ئاساسلىق مەنبەسى. BCAA كاتابولىزمىنىڭ نېرۋا ئېنېرگىيەسى ئالمىشىشىغا قوشقان تۆھپىسى، گلۇتامات ۋە GABA نىڭ نېرۋا ئۆتكۈزۈش رولىدىن باشقا (44)، بۇ مېخانىزملارنىڭ تىرىك جانلىقلارغا ھېچقانداق دەلىلى يوق. شۇڭا، نورمالسىز PN لار ئاتروسېكلورىزمنى ئاشۇرۇش ئارقىلىق ئاسسىمىلياتسىيە جەريانى تەرىپىدىن قوزغىتىلغان TCA ئارىلىق مەھسۇلاتلىرىنىڭ ئىستېمال قىلىنىشىنى ئاپتوماتىك ھالدا تولۇقلىيالايدۇ دەپ پەرەز قىلىش ئاسان. بولۇپمۇ، مىتوخوندىرىيە ئىقتىدارى قالايمىقانلىشىۋاتقان كۆپىيىۋاتقان ھۈجەيرىلەردە ئاسپارتىك كىسلاتاسىغا بولغان ئېھتىياجنىڭ ئېشىشىنى ساقلاپ قېلىش ئۈچۈن PCx نىڭ تەڭشىلىشى تەلەپ قىلىنىشى مۇمكىن (45). قانداقلا بولمىسۇن، بىزنىڭ مېتابولومىك ئانالىزىمىز Mfn2cKO PN لىرىدىكى ئاسپارتىك كىسلاتاسىنىڭ مۇقىم ھالىتىدىكى سەۋىيىسىدە ھېچقانداق مۇھىم ئۆزگىرىشلەرنى بايقىمىدى (S6A-رەسىم)، بۇ كۆپىيىۋاتقان ھۈجەيرىلەر بىلەن مىتوزدىن كېيىنكى نېرۋا ھۈجەيرىلىرى ئوتتۇرىسىدىكى ئاسپارتىك كىسلاتاسىنىڭ مېتابولىزملىق ئىشلىتىلىشىنىڭ ئوخشىماسلىقىنى ئەكىس ئەتتۈرىدۇ. تىرىك جانلىقلاردا ئىقتىدارى قالايمىقان نېرۋا ھۈجەيرىلىرىدە PCx نىڭ تەڭشىلىشىنىڭ ئېنىق مېخانىزمى ئېنىقلانمىغان بولسىمۇ، بىز بۇ بالدۇر ئىنكاسنىڭ نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنىڭ ئوكسىدلىنىش-قايتا ئەسلىگە كېلىش ھالىتىنى ساقلاپ قېلىشتا مۇھىم رول ئوينايدىغانلىقىنى ئىسپاتلىدۇق، بۇ FLIM تەجرىبىلىرىدە كىچىك مېڭە پارچىلىرى ئۈستىدە ئېلىپ بېرىلغان سىناقلاردا ئىسپاتلاندى. بولۇپمۇ، PN لارنىڭ PCx نى تەڭشىشىنىڭ ئالدىنى ئېلىش تېخىمۇ ئوكسىدلىنىش ھالىتىگە ئېلىپ كېلىپ، ھۈجەيرە ئۆلۈشىنى تېزلىتىدۇ. BCAA پارچىلىنىشىنىڭ ئاكتىپلىشىشى ۋە پىرۇۋاتنىڭ كاربونلىشىشى مىتوخوندىرىيە ئىقتىدارى قالايمىقانلىشىشىنىڭ يان تەرەپ توقۇلمىلىرىنى تەسۋىرلەشنىڭ ئۇسۇلى ئەمەس (7). شۇڭلاشقا، ئۇلار OXPHOS كەمچىل نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنىڭ ئالدىنقى ئورۇندا تۇرىدىغان ئالاھىدىلىكىگە ئوخشايدۇ، گەرچە بىردىنبىر ئالاھىدىلىكى بولمىسىمۇ، بۇ نېرۋا چېكىنىشى ئۈچۈن مۇھىم.
كىچىك مېڭە كېسىلى ئادەتتە ئاتاكسىيە شەكلىدە ئىپادىلىنىدىغان ۋە كۆپىنچە PN غا زىيان يەتكۈزىدىغان ھەر خىل نېرۋا چېكىنىش كېسەللىكى (46). بۇ نېرۋا ھۈجەيرىسى توپى مىتوخوندىرىيە ئىقتىدارىنىڭ قالايمىقانلىشىشىغا ئالاھىدە ئاسان ئۇچرايدۇ، چۈنكى چاشقانلاردىكى ئۇلارنىڭ تاللاش خاراكتېرلىك چېكىنىشى ئىنسانلارنىڭ ئومۇرتقا مېڭە ئاتاكسىيەسىنى خاراكتېرلەندۈرىدىغان نۇرغۇن ھەرىكەت ئالامەتلىرىنى قايتا پەيدا قىلىشقا يېتەرلىك (16، 47، 48). خەۋەرلەرگە قارىغاندا، مۇتانت گېنى بار ترانسگېنلىق چاشقان مودېلى ئىنسانلارنىڭ ئومۇرتقا مېڭە ئاتاكسىيەسى بىلەن مۇناسىۋەتلىك بولۇپ، مىتوخوندىرىيە ئىقتىدارىنىڭ قالايمىقانلىشىشىغا ئىگە (49، 50)، بۇ PNPH دىكى OXPHOS كەمچىللىكىنىڭ ئاقىۋىتىنى تەتقىق قىلىشنىڭ مۇھىملىقىنى تەكىتلەيدۇ. شۇڭا، بۇ ئۆزگىچە نېرۋا ھۈجەيرىسى توپىنى ئۈنۈملۈك ئايرىپ تەتقىق قىلىش ئالاھىدە ماس كېلىدۇ. قانداقلا بولمىسۇن، PN لار بېسىمغا ئىنتايىن سەزگۈر بولۇپ، پۈتۈن كىچىك مېڭە ھۈجەيرىسى توپىنىڭ ئاز بىر قىسمىنى ئىگىلەيدۇ، شۇڭا نۇرغۇن ئومىكا ئاساسلىق تەتقىقاتلار ئۈچۈن، ئۇلارنى پۈتۈن ھۈجەيرە سۈپىتىدە تاللاش خاراكتېرلىك ئايرىش يەنىلا قىيىن بىر تەرەپ. باشقا ھۈجەيرە تىپلىرىنىڭ (بولۇپمۇ چوڭلارنىڭ توقۇلمىلىرىنىڭ) بۇلغىنىشىنىڭ مۇتلەق يوقلۇقىنى ئەمەلگە ئاشۇرۇش ئاساسەن مۇمكىن ئەمەس بولسىمۇ، بىز ئۈنۈملۈك ئايرىلىش باسقۇچىنى FACS بىلەن بىرلەشتۈرۈپ، تۆۋەنكى ئېقىمدىكى پروتېئومىكا ئانالىزى ئۈچۈن يېتەرلىك مىقداردا جانلىق نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنى قولغا كەلتۈردۇق، ھەمدە پۈتۈن كىچىك مېڭەنىڭ مەۋجۇت سانلىق مەلۇمات توپلىمىغا سېلىشتۇرغاندا (51) ئاقسىلنىڭ قاپلىنىشى خېلى يۇقىرى (تەخمىنەن 3000 ئاقسىل) غا ئىگە بولدۇق. پۈتۈن ھۈجەيرىلەرنىڭ جانلىقلىقىنى ساقلاش ئارقىلىق، بىز بۇ يەردە تەمىنلىگەن ئۇسۇل بىزگە پەقەت مىتوخوندىرىيەدىكى ماددا ئالمىشىش يوللىرىدىكى ئۆزگىرىشلەرنى تەكشۈرۈپلا قالماي، يەنە ئۇنىڭ سىتوپلازما ئوخشاشلىرىدىكى ئۆزگىرىشلەرنى تەكشۈرۈشكىمۇ يول قويىدۇ، بۇ مىتوخوندىرىيە پەردە بەلگىلىرىنى ئىشلىتىپ ھۈجەيرە تىپىنى بېيىتىشنى تولۇقلايدۇ. مۇرەككەپ توقۇلمىلاردىكى مىتوخوندىرىيە سانىنىڭ يېڭى ئۇسۇلى (52، 53). بىز تەسۋىرلىگەن ئۇسۇل پەقەت پۇركىنجې ھۈجەيرىلىرىنى تەتقىق قىلىش بىلەنلا مۇناسىۋەتلىك ئەمەس، بەلكى مىتوخوندىرىيە ئىقتىدارىنىڭ قالايمىقانلىشىشىنىڭ باشقا مودېللىرىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان كېسەللىك مېڭىسىدىكى ماددا ئالمىشىش ئۆزگىرىشلىرىنى ھەل قىلىش ئۈچۈن ھەر قانداق ھۈجەيرىگە ئاسانلا قوللىنىلىشى مۇمكىن.
ئاخىرىدا، بىز بۇ ماددا ئالمىشىش قايتا تەشكىللىنىش جەريانىدىكى داۋالاش دېرىزىسى تېپىپ چىقتۇق، بۇ جەريان ھۈجەيرە بېسىمىنىڭ ئاساسلىق ئالامەتلىرىنى پۈتۈنلەي ئۆزگەرتەلەيدۇ ۋە نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنىڭ چېكىنىشىنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ. شۇڭا، بۇ يەردە تەسۋىرلەنگەن قايتا سىم ئورنىتىشنىڭ فۇنكسىيەلىك تەسىرىنى چۈشىنىش مىتوخوندىرىيە ئىقتىدارىنىڭ قالايمىقانلىشىشى مەزگىلىدە نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنىڭ ھاياتىي كۈچىنى ساقلاپ قېلىش ئۈچۈن مۇمكىن بولغان داۋالاش ئۇسۇللىرى توغرىسىدا ئاساسىي چۈشەنچىلەرنى بېرىشى مۇمكىن. بۇ پىرىنسىپنىڭ باشقا نېرۋا كېسەللىكلىرىگە قوللىنىلىشىنى تولۇق ئاشكارىلاش ئۈچۈن، باشقا مېڭە ھۈجەيرىلىرىدىكى ئېنېرگىيە ئالمىشىشىدىكى ئۆزگىرىشلەرنى تەھلىل قىلىشقا قارىتىلغان كەلگۈسىدىكى تەتقىقاتلار زۆرۈر.
MitoPark چاشقانلىرى ئىلگىرى تەسۋىرلەنگەن (31). loxP يان تەرەپلىك Mfn2 گېنى بار C57BL/6N چاشقانلىرى ئىلگىرى تەسۋىرلەنگەن (18) ۋە L7-Cre چاشقانلىرى بىلەن چېتىشتۇرۇلغان (23). نەتىجىدە ھاسىل بولغان قوش ھېتېروزىگوت ئەۋلادلار ئاندىن Mfn2loxP/Mfn2loxP چاشقانلىرى بىلەن چېتىشتۇرۇلۇپ، Mfn2 ئۈچۈن پۇركىنجېغا خاس گېننى يوقىتىش (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) ھاسىل قىلىنغان. جۈپلىشىشنىڭ بىر قىسمىدا، Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP ئاللېلى (stop-mtYFP) قوشۇمچە چېتىشتۇرۇش ئارقىلىق كىرگۈزۈلگەن (20). بارلىق ھايۋانلار جەريانلىرى ياۋروپا، دۆلەت ۋە ئاپپاراتلارنىڭ يېتەكچىلىكىگە ئاساسەن ئېلىپ بېرىلغان ۋە گېرمانىيەنىڭ شىمالىي رېين-ۋېستفالىيە ئۆلكىسىنىڭ Umwelt ۋە Verbraucherschutz شەھىرىدىكى LandesamtfürNatur تەرىپىدىن تەستىقلانغان. ھايۋانلار خىزمىتى يەنە ياۋروپا تەجرىبىخانا ھايۋانات پەنلىرى بىرلەشمىسىنىڭ يېتەكچىلىكىگە ئەمەل قىلىدۇ.
ھامىلىدار ئايالنىڭ بوينى چىقىپ كەتكەن قىسمىنى بىھۇش قىلغاندىن كېيىن، چاشقان ئېمبىرىيونى ئايرىۋېلىندى (E13). مېڭە پوستلىقى 10 mM Hepes قوشۇلغان Hanks تەڭپۇڭلاشتۇرۇلغان تۇز ئېرىتمىسى (HBSS) دا پارچىلىنىپ، پاپائىن (20 U/ml) ۋە سىستېئىن (1μg/ml) قوشۇلغان Dulbecco ئۆزگەرتىلگەن بۈركۈت ئورتاسىغا قويۇلدى. توقۇلمىلارنى DMEM دا ئىنزىما قىلىپ، ئېنزىملىق ھەزىم قىلىش ئارقىلىق ئايرىۋېتىڭ. Ml) 37°C دا 20 مىنۇت، ئاندىن %10 ھامىلە كالا قان زەردابى قوشۇلغان DMEM دا مېخانىكىلىق ھالدا ئۇۋىلاڭ. ھۈجەيرىلەر 6 سانتىمېتىرلىق مەدەنىيەت قاچىسىغا 2×106 زىچلىقتا ياكى 0.5×105 ھۈجەيرە/cm2 زىچلىقتا سۈرەت ئانالىزى ئۈچۈن پولىزىن بىلەن قاپلانغان ئەينەك قاپاققا ئۇرۇق سېلىندى. 4 سائەتتىن كېيىن، ئورتا %1 B27 قوشۇمچە ماددىسى ۋە 0.5 mM GlutaMax قوشۇلغان نېرۋا-بازال قان زەردابىسىز ئورتا بىلەن ئالماشتۇرۇلدى. ئاندىن نېرۋا ھۈجەيرىلىرى تەجرىبە جەريانىدا 37 سېلسىيە گرادۇس ۋە %5 CO2 تېمپېراتۇرىسىدا ساقلىنىپ، ھەپتىدە بىر قېتىم ئوزۇقلاندۇرۇلدى. سىناق نەيچىسىدە قايتا بىرىكمە ھاسىل قىلىش ئۈچۈن، سىناق نەيچىسىدە ئىككىنچى كۈنى نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنى داۋالاش ئۈچۈن تۆۋەندىكى AAV9 ۋىرۇس ۋېكتورىدىن 3μl (24 قۇدۇقلۇق مەدەنىيەت قاچىسى) ياكى 0.5μl (24 قۇدۇقلۇق تەخسە) ئىشلىتىلدى: AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene، كاتالوگ نومۇرى 105530-AAV9) ۋە AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene، كاتالوگ نومۇرى 105545-AAV9).
چاشقان Mfn1 ۋە Mfn2 تولۇقلىغۇچى DNA (ئايرىم-ئايرىم ھالدا Addgene پلازمىدى #23212 ۋە #23213 دىن ئېلىنغان) C ئۇچىدا V5 تىزىملىكى (GKPIPNPLLGLDST) بىلەن بەلگىلىنىدۇ ۋە T2A تىزىملىكى ئارقىلىق mCherry بىلەن بىرلەشتۈرۈلىدۇ. Grx1-roGFP2 Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) نىڭ سوۋغىسى. ئادەتتىكى كىلونلاش ئۇسۇلى ئارقىلىق tdTomato كاسسىسىنى ئالماشتۇرۇش ئارقىلىق، كاسسىتا pAAV-CAG-FLEX-tdTomato ئاساسىي سىستېمىسىغا (Addgene پايدىلىنىش نومۇرى 28306) ئۆزگەرتىلىپ، pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5، pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 ۋە pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 ۋېكتورلىرى ھاسىل قىلىندى. pAAV-CAG-FLEX-mCherry كونترول ۋېكتورىنى ھاسىل قىلىش ئۈچۈن ئوخشاش ئۇسۇل قوللىنىلدى. AAV-shPCx قۇرۇلمىسىنى ھاسىل قىلىش ئۈچۈن، پلازمىد AAV ۋېكتورى (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) تەلەپ قىلىنىدۇ، بۇ پلازمىد چاشقان PCx نى نىشانلىغان shRNA نى كودلايدىغان DNA تەرتىپىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ (5′CTTTCGCTCAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). U6 پروموتېرىنىڭ كونتروللۇقى ئاستىدا، CMV پروموتېرىنىڭ كونتروللۇقى ئاستىدا mCherry ئىشلىتىلىدۇ. ياردەمچى AAV ۋېكتورلىرىنى ئىشلەپچىقىرىش ئىشلەپچىقارغۇچىنىڭ كۆرسەتمىسىگە ئاساسەن ئېلىپ بېرىلدى (Cell Biolabs). قىسقىسى، كالتسىي فوسفات ئۇسۇلى ئارقىلىق mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5)، mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) نى ئېلىپ يۈرىدىغان يۆتكىلىش پلازمىسىدىنى ئىشلىتىپ، 293AAV ھۈجەيرىسى-T2A-MFN1-V5)، mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ياكى Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) كودلىغۇچى گېنىنى، شۇنداقلا AAV1 كاپسىد ئاقسىلى ۋە قوشۇمچە ئاقسىلنى كودلاڭ. خام ۋىرۇس ئۈستۈنكى سۇيۇقلۇقى قۇرۇق مۇز/ئېتانول مۇنچىسىدا توڭلىتىش-ئېرىتىش دەۋرىيلىكى ۋە فوسفات بۇففېرلىق تۇزلۇق ئېرىتمىسى (PBS) دا ھۈجەيرىلەرنى ئېرىتىش ئارقىلىق قولغا كەلتۈرۈلدى. AAV ۋېكتورى ئۈزۈلمەي يودىكسانول گرادىيېنتى ئۇلترا مەركەزدىن قاچۇرۇش ئۇسۇلى ئارقىلىق تازىلىنىپ (32،000 ئايلىنىش/مىنۇت ۋە 4°C دە 24 سائەت)، Amicon ئۇلترا-15 مەركەزدىن قاچۇرۇش فىلتىرى ئارقىلىق قويۇقلاشتۇرۇلدى. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 گېنوم كۆچۈرمىسى (GC)/ml]، AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml)، AAV1-CAG-FLEX نىڭ گېنوم تىتىرى ئىلگىرىكى تەسۋىرلەنگەندەك (54)، ھەقىقىي ۋاقىتلىق مىقدارلىق PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) ۋە AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml) ئارقىلىق ئۆلچەندى.
ئاساسلىق نېرۋا ھۈجەيرىلىرى مۇزدەك سوغۇق 1x PBS دا قىرىپ ئېلىندى، دانچە شەكلىدە پارچىلىنىپ، ئاندىن فوسفاتازا ۋە پروتېئازا چەكلىگۈچىسى (Roche) بار %0.5 Triton X-100 / %0.5 Natriy Deoxycholate/PBS ئېرىتىش بۇفېرىدا بىر خىل ھالەتكە كەلتۈرۈلدى. ئاقسىل مىقدارى بىسىنخونىن كىسلاتاسى سىنىقى (Thermo Fisher Scientific) ئارقىلىق ئۆلچەندى. ئاندىن ئاقسىللار SDS-پولىئاكرىلامىد گېلى ئېلېكتروفورېزى ئارقىلىق ئايرىلدى، ئاندىن پولىۋىنىلىدىن فتور پەردىسىگە سۈرتۈلدى (GE Healthcare). ئالاھىدە بولمىغان ئورۇنلارنى توسۇپ، ئاساسلىق ئانتىتېلا (تەپسىلاتىنى S1 جەدۋىلىگە قاراڭ) بىلەن %5 سۈتتە TBST (Tween بىلەن Tris-بۇفېرلىق تۇز سۈيى) دا يۇيۇش باسقۇچلىرى ۋە TBST Incubate دىكى ئىككىنچى دەرىجىلىك ئانتىتېلا بىلەن ئىنۇباتسىيە قىلىندى. ئاساسلىق ئانتىتېلا بىلەن +4°C تېمپېراتۇرىدا بىر كېچە ئىنۇباتسىيە قىلىندى. يۇيغاندىن كېيىن، ئىككىنچى دەرىجىلىك ئانتىتېلانى ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 2 سائەت سۈرتۈڭ. ئاندىن، ئوخشاش داغنى β-ئاكتىنغا قارشى ئانتىتېلا بىلەن ئىنۇباتسىيە قىلىش ئارقىلىق، ئوخشاش يۈك جەزملەشتۈرۈلدى. خېمىلۇمىنېتسېنسىيەگە ئۆزگەرتىش ۋە خېمىلۇمىنېتسېنسىيەنى كۈچەيتىش ئارقىلىق بايقاش (GE Healthcare).
ئىلگىرى ئەينەك قاپاققا ئورنىتىلغان نېرۋا ھۈجەيرىلىرى بەلگىلەنگەن ۋاقىت نۇقتىسىدا ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 10 مىنۇت %4 پارافورمالدېھىد (PFA)/PBS بىلەن بېكىتىلدى. قاپاققا ئالدى بىلەن ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا %0.1 Triton X-100/PBS 5 مىنۇت، ئاندىن توسۇش بۇفېرىغا [%3 كالا قان زەردابى ئالبۇمىنى (BSA)/PBS] سىڭدۈرۈلدى. ئىككىنچى كۈنى، قاپاققا ئورنىتىلغان ماددىنى توسۇش بۇفېرى بىلەن يۇيۇپ، مۇۋاپىق فلۇئوروفور بىلەن بىرلەشتۈرۈلگەن ئىككىنچى دەرىجىلىك ئانتىتېلا بىلەن ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 2 سائەت ئىنكۇباتسىيە قىلىندى؛ ئاخىرىدا، ئەۋرىشكىلەر PBS دا پاكىز يۇيۇلۇپ، 4′,6-دىئامىدىنو-2-فېنىلىندول (DAPI) بىلەن قارشى رەڭ بېرىلىپ، ئاندىن Aqua-Poly/Mount بىلەن مىكروسكوپ سىيرىلمىسىغا بېكىتىلدى.
چاشقانلار (ئەر ۋە ئايال) كېتامىن (130 مىللىگرام/كىلوگرام) ۋە كىسىلازىن (10 مىللىگرام/كىلوگرام) قورساق بوشلۇقىغا ئوكۇل قىلىنىپ، كارپروفېن ئاغرىق پەسەيتىش دورىسى (5 مىللىگرام/كىلوگرام) تېرە ئاستىغا ئوكۇل قىلىندى. ئاندىن ئىسسىق ياستۇق ئورنىتىلغان ستېرېئوتاكتىك ئەسۋابقا (Kopf) سېلىندى. باش سۆڭىكىنى ئېچىپ، چىش بۇرغىسى ئارقىلىق كىچىك مېڭە پوستلىقىنىڭ سۆڭەك سۆڭىكىگە ماس كېلىدىغان قىسمىنى نېپىزلىتىڭ (لامبدادىن: قۇيرۇق 1.8، يان 1، IV ۋە V پارچىلىرىغا ماس كېلىدۇ). ئاستىدىكى قان تومۇرلارنىڭ بۇزۇلۇشىنىڭ ئالدىنى ئېلىش ئۈچۈن، باش سۆڭىكىدە ئېھتىيات بىلەن كىچىك تۆشۈك ئېچىش ئۈچۈن ئېگىلىپ تۇرىدىغان ئوكۇل ئىگنىسى ئىشلىتىڭ. ئاندىن نېپىز تارتىلغان ئەينەك كاپىللانى ئاستا-ئاستا مىكرو تۆشۈككە كىرگۈزۈلىدۇ (-1.3 دىن -1 گىچە قاتتىق پەردىنىڭ قورساق تەرىپىدە)، ۋە 200 دىن 300 nl غىچە AAV قول ئوكۇلى (Narishige) ئارقىلىق مىكرو ئوكۇلغا (Narishige) بىر قانچە قېتىم تۆۋەن بېسىم ئاستىدا 10 دىن 20 مىنۇتقىچە بولغان ۋاقىت ئىچىدە ئوكۇل قىلىنىدۇ. دورا قۇيۇلغاندىن كېيىن، ۋىرۇسنىڭ تولۇق تارقىلىشى ئۈچۈن، كاپىللانى يەنە 10 مىنۇت قويۇڭ. كاپىللانى چىقىرىۋېتىلگەندىن كېيىن، يارا ياللۇغىنى ئەڭ تۆۋەن چەككە چۈشۈرۈش ۋە ھايۋاننىڭ ئەسلىگە كېلىشى ئۈچۈن تېرىسى ئېھتىيات بىلەن تىكىلىدۇ. ھايۋانلارغا ئوپېراتسىيەدىن كېيىن بىر قانچە كۈن ئاغرىق پەسەيتكۈچى (كاسپوفېن) بېرىلدى، بۇ جەرياندا ئۇلارنىڭ بەدەن ئەھۋالى ئەستايىدىل كۆزىتىلدى، ئاندىن بەلگىلەنگەن ۋاقىتتا ئۆلۈم جازاسى بېرىلدى. بارلىق تەرتىپلەر ياۋروپا، دۆلەت ۋە ئاپپاراتلارنىڭ كۆرسەتمىلىرىگە ئاساسەن ئېلىپ بېرىلدى ھەمدە گېرمانىيەنىڭ شىمالىي رېيىن-ۋېستفالىيە ئۆلكىسىدىكى Umwelt and Verbraucherschutz دىكى LandesamtfürNatur تەرىپىدىن تەستىقلاندى.
ھايۋانلارغا كېتامىن (100 مىللىگرام/كىلوگرام) ۋە كسىلازىن (10 مىللىگرام/كىلوگرام) بىلەن بېھۇش قىلىندى، يۈرەككە ئالدى بىلەن 0.1 M PBS، ئاندىن PBS دا %4 PFA قوشۇلدى. توقۇلمىلار پارچىلىنىپ، 4 سېلسىيە گرادۇستا بىر كېچە %4 PFA/PBS بىلەن بېكىتىلدى. PBS دا بېكىتىلمىگەن مېڭىدىن ساگىتتال كېسىشمىلەرنى (50 μm قېلىنلىقتا) تەييارلاش ئۈچۈن تىترەش پىچىقى (Leica Microsystems GmbH, ۋيېنا, ئاۋسترىيە) ئىشلىتىلدى. باشقىچە بەلگىلىمە بولمىسا، ئەركىن لەيلەپ تۇرغان كېسىشمىلەرنى بوياش يۇقىرىدا بايان قىلىنغاندەك (13) ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا ئېلىپ بېرىلدى ۋە ئارىلاشتۇرۇلدى. قىسقىسى، ئالدى بىلەن، ئېرىشكەن كېسىشمىلەر ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا %0.5 Triton X-100/PBS بىلەن 15 مىنۇت سىڭدۈرۈلدى؛ بەزى ئېپىتوپلار (Pcx ۋە Shmt2) ئۈچۈن، 80 سېلسىيە گرادۇستا (PH 9) tris-EDTA بۇفېرىدا كېسىشمىلەرنى بۇ قەدەمنىڭ ئورنىغا 25 مىنۇت قىزىتىڭ. ئاندىن، بۆلەكلەر بىر قېتىملىق ئانتىتېلا (S1-جەدۋەلگە قاراڭ) بىلەن توسۇش بۇفېرىدا (3% BSA/PBS) 4 سېلسىيە گرادۇستا بىر كېچە ئارىلاشتۇرۇپ ئىنكۇباتسىيە قىلىندى. ئەتىسى، بۆلەكلەر توسۇش بۇفېرىدا يۇيۇلۇپ، مۇۋاپىق فلۇئوروفور بىلەن بىرلەشتۈرۈلگەن ئىككىنچى دەرىجىلىك ئانتىتېلا بىلەن ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 2 سائەت ئىنكۇباتسىيە قىلىندى؛ ئاخىرىدا، بۆلەكلەر PBS دا پاكىز يۇيۇلۇپ، DAPI بىلەن قايتا بوялدى ۋە ئاندىن AquaPolymount بىلەن مىكروسكوپ سىيرىلمىسىغا ئورنىتىلدى.
ئەۋرىشكە رەسىمگە ئېلىش ئۈچۈن ئاق نۇر لازېرى ۋە 405 دىئودلۇق ئۇلترابىنەفشە نۇر لازېرى بىلەن تەمىنلەنگەن لازېرلىق سىكانىرلاش كونفوكال مىكروسكوپى (TCS SP8-X ياكى TCS رەقەملىك يورۇقلۇق جەدۋىلى، Leica مىكرو سىستېمىسى) ئىشلىتىلدى. فلۇئوروفورنى قوزغىتىپ، سىگنالنى گىبرىد دېتېكتور (HyDs) بىلەن توپلاش ئارقىلىق، LAS-X يۇمشاق دېتالى Nyquist ئەۋرىشكە ئېلىش ئۇسۇلىغا ماس كېلىدىغان قاتلاملىق رەسىملەرنى تەرتىپلىك ھالەتتە توپلاش ئۈچۈن ئىشلىتىلدى: مىقدارسىز تاختىلار ئۈچۈن، بۇ يۇقىرى دىنامىك سىگناللار (مەسىلەن، بەدەن ھۈجەيرىلىرى ۋە دېندىرىتلاردا) mtYFP) BrightR ھالىتىدە PN سانىنى بايقاش ئۈچۈن HyD نى ئىشلىتىڭ). ئارقا كۆرۈنۈشنى ئازايتىش ئۈچۈن 0.3 دىن 6 ns غىچە بولغان ئارىلىقتىكى دەرۋازا قوللىنىلدى.
تۈرگە ئايرىلغان ھۈجەيرىلەرنىڭ ھەقىقىي ۋاقىتلىق رەسىمگە تارتىش ئۇسۇلى. %1 B27 قوشۇمچە ماددىسى ۋە 0.5 mM GlutaMax قوشۇلغان Neurobasal-A مۇھىتىدا تۈرگە ئايرىغاندىن كېيىن، ھۈجەيرىلەر دەرھال پولى-l-لىزىن بىلەن قاپلانغان ئەينەك سىيرىلمىلارغا (μ-Slide8 Well, Ibidi, كاتالوگ نومۇرى 80826) ئۇرۇقلاندۇرۇلدى. ئاندىن ھۈجەيرىلەرنىڭ چۆكۈپ كېتىشى ئۈچۈن ئۇنى 37 سېلسىيە گرادۇسلۇق تېمپېراتۇرىدا ۋە %5 CO2 دا 1 سائەت ساقلىدى. ھەقىقىي ۋاقىتلىق رەسىمگە تارتىش ئۇسۇلى ئاق لازېرلىق، HyD، 63×[1.4 سانلىق دىئافراگما (NA)] ماي ئوبيېكتىپ لىنزىسى ۋە قىزىتىش باسقۇچى بىلەن تەمىنلەنگەن Leica SP8 لازېرلىق سىكانىرلاش كونفوكال مىكروسكوپىدا ئېلىپ بېرىلدى.
چاشقانغا تېزلا كاربون تۆت ئوكسىد بىلەن بېھۇش قىلدۇرۇلۇپ، بېشى كېسىۋېتىلدى، مېڭىسى باش سۆڭىكىدىن تېزلا چىقىرىۋېتىلدى ۋە 200μm قېلىنلىقتا (13C بەلگە قويۇش تەجرىبىسى ئۈچۈن) ياكى 275μm قېلىنلىقتا (ئىككى فوتون تەجرىبىسى ئۈچۈن) ساگىتتال بۆلىكىگە كېسىپ، تۆۋەندىكى ماتېرىياللار بىلەن تولدۇرۇلدى. مۇزقايماق (HM-650 V، Thermo Fisher Scientific، Walldorf، گېرمانىيە) تۆۋەندىكى ماددىلار بىلەن تولدۇرۇلدى: 125 mM مۇزدەك سوغۇق، كاربونغا تويۇنغان (95% O2 ۋە 5% CO2) تۆۋەن Ca2 + سۈنئىي مېڭە ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقى (ACSF) NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM ناترىي فوسفات بۇفېر، 25 mM NaHCO3، 25 mM گلۇكوزا، 0.5 mM CaCl2 ۋە 3.5 mM MgCl2 (ئوسموس بېسىمى 310 دىن 330 mmol غىچە). ئېلىنغان مېڭە پارچىلىرىنى يۇقىرى Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM ناترىي فوسفات بۇفېر، 25.0 mM NaHCO3، 25.0 mM d-گلېكوزا، 1.0 mM CaCl2 ۋە 2.0 mM MgCl2) ئوتتۇراھال (pH قىممىتى 7.4 ۋە 310 دىن 320 mmol غىچە) بولغان ئالدىن ئىنكۇباتسىيە كامېراسىغا يۆتكەڭ.
رەسىمگە تارتىش جەريانىدا، پارچىلار مەخسۇس رەسىمگە تارتىش ئۆيىگە يۆتكەلدى، ۋە تەجرىبە 32° دىن 33°C غىچە بولغان مۇقىم تېمپېراتۇرىدا ئۈزلۈكسىز ACSF پېرفۇزىيەسى ئاستىدا ئېلىپ بېرىلدى. پارچىلارنى رەسىمگە تارتىش ئۈچۈن Leica 25x ئوبيېكتىپ لىنزىسى (NA 0.95، سۇ) بىلەن تەمىنلەنگەن كۆپ فوتونلۇق لازېرلىق سىكانىرلاش مىكروسكوپى (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems)، Ti: Sapphire laser (Chameleon Vision II, Coherent) ئىشلىتىلدى. FLIM مودۇلى (PicoHarp300, PicoQuant).
Grx1-roGFP2 نىڭ FLIM ى. PN لارنىڭ سىتوپلازما ئوكسىدلىنىش-قايتالىنىش ھالىتىدىكى ئۆزگىرىشلەر ساگىتتال مېڭە پارچىلىرىدىكى ئىككى فوتونلۇق FLIM ئارقىلىق ئۆلچەندى، بۇ يەردە Grx1-roGFP2 بىئوسېنسورى PN لارنى نىشان قىلدى. PN قەۋىتىدە، PN نىڭ مەۋجۇت ئىكەنلىكىگە كاپالەتلىك قىلىش ئۈچۈن، پارچىنىڭ يۈزىدىن تەخمىنەن 50 دىن 80 μm گىچە بولغان ئارىلىقتا ئېرىشىش مەيدانى تاللىنىدۇ (يەنى، دېندرىتلار بويىدا مونچاق شەكىللىك قۇرۇلما ياكى نېرۋا مورفولوگىيەلىك ئۆزگىرىشلەرنىڭ يوقلۇقى) ۋە قوش مۇسبەت roGFP2 سېنزورى ۋە shRNA PCx ياكى ئۇنىڭ كونترول تەرتىپىنى كودلايدىغان AAV (ھەر بىرى mCherry نى بىرلىكتە ئىپادىلەيدۇ). 2x رەقەملىك چوڭايتىش [قوزغىتىش دولقۇن ئۇزۇنلۇقى: 890 nm؛ 512 nm 512 پىكسېل] ئارقىلىق يەككە قاتلاملىق رەسىملەرنى توپلاڭ ۋە ئەگرى سىزىقنى ماسلاشتۇرۇش ئۈچۈن يېتەرلىك فوتون توپلانغانلىقىغا كاپالەتلىك قىلىش ئۈچۈن (جەمئىي 1000 فوتون) 2 دىن 3 مىنۇتقىچە بولغان ئوتتۇرىچە رەسىم ئىشلىتىلىدۇ. Grx1-roGFP2 زوندىنىڭ سەزگۈرلۈكى ۋە FLIM شارائىتىنى تەكشۈرۈش، پېرفۇزىيە ACSF غا سىرتقى 10 mM H2O2 قوشۇلغاندا (ئوكسىدلىنىشنى ئەڭ چوڭ چەككە يەتكۈزۈش، نەتىجىدە ئۆمۈرنى ئۇزارتىش)، ئاندىن 2 mM دىتىئوترېئىتول قوشۇش (ئازدۇرۇش دەرىجىسىنى ئەڭ تۆۋەن چەككە چۈشۈرۈش، نەتىجىدە ئۆمۈرنى قىسقارتىش) ئارقىلىق roGFP2 نىڭ ئۆمۈر قىممىتىنى نازارەت قىلىش ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى (S8، D دىن G گىچە). قولغا كەلتۈرۈلگەن نەتىجىلەرنى تەھلىل قىلىش ئۈچۈن FLIMfit 5.1.1 يۇمشاق دېتالىنى ئىشلىتىڭ، پۈتۈن رەسىمنىڭ يەككە ئېكسپونېنسىيال پارچىلىنىش ئەگرى سىزىقىنى ئۆلچەنگەن IRF (ئەسۋاب جاۋاب فۇنكسىيەسى) غا ماسلاشتۇرۇڭ، χ2 تەخمىنەن 1 گە تەڭ. يەككە PN نىڭ ئۆمۈرنى ھېسابلاش ئۈچۈن، نېرۋا تېنىنىڭ ئەتراپىدىكى ماسكا قولدا سىزىلدى، ھەمدە ھەر بىر ماسكىدىكى ئوتتۇرىچە ئۆمۈر مىقدارى مىقدارلاشتۇرۇش ئۈچۈن ئىشلىتىلدى.
مىتوخوندىرىيە پوتېنسىيالى ئانالىزى. ئۆتكۈر بۆلەك 30 مىنۇت ئىچىدە بىۋاسىتە پېرفۇزىيەلەنگەن ACSF غا قوشۇلغان 100 nM TMRM بىلەن ئىنكۇباتسىيە قىلىنغاندىن كېيىن، PN نىڭ مىتوخوندىرىيە پوتېنسىيالى ئۆزگىرىشى ئىككى فوتونلۇق مىكروسكوپ ئارقىلىق ئۆلچەندى. TMRM رەسىمگە ئېلىش زوندنى 920 nm دا قوزغىتىپ، ئىچكى HyD (تېترامېتىلرودامىن ئىزوتىئوسىئانات: 585/40 nm) ئارقىلىق سىگنال توپلاش ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى؛ ئوخشاش قوزغىتىش دولقۇن ئۇزۇنلۇقىنى ئىشلىتىپ، ئەمما mtYFP رەسىمگە ئېلىش ئۈچۈن باشقا ئىچكى HyD (FITC: 525/50) ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى. يەككە ھۈجەيرە سەۋىيىسىدىكى مىتوخوندىرىيە پوتېنسىيالىنى باھالاش ئۈچۈن ImageJ نىڭ رەسىم ھېسابلىغۇچ قىستۇرمىسىنى ئىشلىتىڭ. قىسقىسى، قىستۇرما تەڭلىمى: سىگنال = min (mtYFP, TMRM) پۇركىنجې سومالىدىكى TMRM سىگنالىنى كۆرسىتىدىغان مىتوخوندىرىيە رايونىنى ئېنىقلاش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدۇ. ئاندىن ھاسىل بولغان ماسكىدىكى پىكسېل كۆلىمى مىقدارلاشتۇرۇلىدۇ، ئاندىن mtYFP قانىلىنىڭ ماس كېلىدىغان چەكلىمە يەككە قەۋەتلىك رەسىمىدە نورماللاشتۇرۇلۇپ، مىتوخوندىرىيە پوتېنسىيالىنى كۆرسىتىدىغان مىتوخوندىرىيە قىسمىغا ئېرىشىلىدۇ.
رەسىم Huygens Pro (ئىلمىي ھەجىملىك ​​رەسىم سىزىش) يۇمشاق دېتالى ئارقىلىق ئېنىقلاندى. كاشىلارنىڭ سىكانىرلانغان رەسىملىرى ئۈچۈن، LAS-X يۇمشاق دېتالى تەمىنلىگەن ئاپتوماتىك تىكىش ئالگورىزىمى ئارقىلىق يەككە كاشىنىڭ مونتاژى ياسىلىدۇ. رەسىمنى كالىبراتسىيە قىلغاندىن كېيىن، رەسىمنى تېخىمۇ پىششىقلاپ، يورۇقلۇق ۋە كونتراستنى بىردەك تەڭشەش ئۈچۈن ImageJ ۋە Adobe Photoshop ئىشلىتىڭ. گرافىك تەييارلاش ئۈچۈن Adobe Illustrator ئىشلىتىڭ.
mtDNA نىڭ مەركەزلىك ئانالىزى. mtDNA زەخمىلىنىش سانى كونفوكال مىكروسكوپ ئارقىلىق DNA غا قارشى ئانتىتېلا بىلەن بەلگە قويۇلغان كىچىك مېڭە بۆلەكلىرىدە مىقدارلاشتۇرۇلدى. ھەر بىر نىشان رايونى ھۈجەيرە تېنى ۋە ھەر بىر ھۈجەيرىنىڭ يادروسى ئۈچۈن يارىتىلدى، ھەمدە ئايرىم رايون Multi Measure قىستۇرمىسى (ImageJ يۇمشاق دېتالى) ئارقىلىق ھېسابلىنىدۇ. ھۈجەيرە تېنى رايونىدىن يادرو رايونىنى چىقىرىۋېتىپ، سىتوپلازما رايونىنى ئېلىڭ. ئاخىرىدا، Analyze Particles قىستۇرمىسى (ImageJ يۇمشاق دېتالى) ئارقىلىق چەك رەسىمدىكى mtDNA نى كۆرسىتىدىغان سىتوپلازما DNA نۇقتىلىرىنى ئاپتوماتىك مىقدارلاشتۇرۇلدى، ھەمدە ئېرىشكەن نەتىجىلەر CTRL چاشقانلىرىنىڭ PN ئوتتۇرىچە قىممىتىگە نورماللاشتۇرۇلدى. نەتىجىلەر ھەر بىر ھۈجەيرىدىكى نۇكلېئوزىدلارنىڭ ئوتتۇرىچە سانى سۈپىتىدە ئىپادىلىنىدۇ.
ئاقسىل ئىپادىسىنى تەھلىل قىلىش. ImageJ نىڭ رەسىم ھېسابلىغۇچ قىستۇرمىسىنى ئىشلىتىپ، يەككە ھۈجەيرە سەۋىيەسىدىكى PN دىكى ئاقسىل ئىپادىسىنى باھالاڭ. قىسقىسى، ماس كېلىدىغان قانالنىڭ يەككە قەۋەتلىك كونفوكال رەسىمىدە، سىگنال = min (mtYFP، ئانتىتېلا) فورمۇلاسى ئارقىلىق، پۇركىنادىكى مەلۇم بىر ئانتىتېلاغا ئىممۇنىتېت رېئاكتىپلىقىنى كۆرسىتىدىغان مىتوخوندىرىيە رايونى ئېنىقلىنىدۇ. ئاندىن نەتىجىدە ھاسىل بولغان ماسكىدىكى پىكسېل رايونى مىقدارلاشتۇرۇلىدۇ، ئاندىن كۆرسىتىلگەن ئاقسىلنىڭ مىتوخوندىرىيە قىسمىنى ئېلىش ئۈچۈن mtYFP قانىلىنىڭ ماس كېلىدىغان چەك قىممىتىدىكى يەككە قەۋەتلىك رەسىمىدە نورماللاشتۇرۇلىدۇ.
پۇركىنجې ھۈجەيرىسى زىچلىقىنى تەھلىل قىلىش. ImageJ نىڭ ھۈجەيرە ھېسابلىغۇچ قىستۇرمىسى سانالغان پۇركىنجې ھۈجەيرىلىرىنىڭ سانىنى سانالغان ھۈجەيرىلەر ئىگىلىگەن كىچىك مېڭە ھالقىسىنىڭ ئۇزۇنلۇقىغا بۆلۈش ئارقىلىق پۇركىنجې زىچلىقىنى باھالاشتا ئىشلىتىلدى.
ئەۋرىشكە تەييارلاش ۋە يىغىش. كونترول گۇرۇپپىسى ۋە Mfn2cKO چاشقانلىرىنىڭ مېڭىسى 0.1 M فوسفات بۇففېر (PB) دىكى %2 PFA/%2.5 گلۇتارالدېھىدقا بېكىتىلدى، ئاندىن تاجسىمان كېسىشمىلەر كىرپىكلەر (Leica Mikrosysteme GmbH, ۋيېنا, ئاۋسترىيە) ئارقىلىق تەييارلاندى (قالىنلىقى 50 دىن 60 μm گىچە). ئاندىن ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا %1 os tetraoxide ۋە %1.5 كالىي فېرروسىئانىدتا PB بۇففېرغا بېكىتىلىپ 1 سائەت ساقلاندى. كېسىشمىلەر ئۈچ قېتىم دىستىللانغان سۇ بىلەن يۇيۇلدى، ئاندىن %1 ئۇرانىل ئاتسېتات تەركىبىدىكى %70 ئېتانول بىلەن 20 مىنۇت بوялدى. ئاندىن كېسىشمىلەر دەرىجىگە ئايرىلغان ئىسپىرتتا سۇسىزلاندۇرۇلۇپ، كرېمنىي بىلەن قاپلانغان ئەينەك سىيرىلمىلىرى ئارىسىغا Durcupan ACM (Araldite قۇيۇش رېزىنكىسى M) ئېپوكسى رېزىنكىسى (ئېلېكترون مىكروسكوپىيە پەنلىرى، كاتالوگ نومۇرى 14040) غا سېلىندى، ئاخىرىدا 60 سېلسىيە گرادۇستا ئوچاقتا 48 سائەت پولىمېرلاشتۇرۇلدى. كىچىك مېڭە پوستلاق رايونى تاللىنىپ، 50 نانومېتىرلىق ئۇلترا نېپىز پارچىلار Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, ۋيېنا، ئاۋسترىيە) دا كېسىلىپ، پولىسترېل پىلاستىنكا بىلەن قاپلانغان 2×1 مىللىمېتىرلىق مىس يېرىق توردا تاللاندى. پارچىلار H2O دىكى %4 ئۇرانىل ئاتسېتات ئېرىتمىسى بىلەن 10 مىنۇت بوياپ، H2O بىلەن بىر قانچە قېتىم يۇيۇلۇپ، ئاندىن H2O دىكى رېينولدس قوغۇشۇن سىترات بىلەن 10 مىنۇت يۇيۇلۇپ، ئاندىن H2O بىلەن بىر قانچە قېتىم يۇيۇلدى. مىكروسكوپلار Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) نىڭ ئېلېكترونلۇق مىكروسكوپى بىلەن TVIPS (Tietz سىن ۋە رەسىم بىر تەرەپ قىلىش سىستېمىسى) TemCam-F416 رەقەملىك كامېراسى (TVIPS GmbH, Gauting, USA) ئارقىلىق ئېلىندى.
AAV بىلەن يۇقۇملانغان چاشقانلارنىڭ مېڭىسى ئايرىلىپ، 1 مىللىمېتىر قېلىنلىقتىكى ساگىتتال بۆلىكىگە كېسىلدى، كىچىك مېڭە فلۇئورېسسېنسىيەلىك مىكروسكوپ ئارقىلىق تەكشۈرۈلۈپ، AAV بىلەن يۇقۇملانغان ھالقىنى (يەنى mCherry ئىپادىلىگەن) ئېنىقلىدى. پەقەت AAV ئوكۇلى ئارقىلىق كەم دېگەندە ئىككى قېتىم ئارقا-ئارقىدىن كېلىدىغان كىچىك مېڭە ھالقىسىدىكى پۇركىنجې ھۈجەيرە قەۋىتىنىڭ (يەنى دېگۈدەك پۈتۈن قەۋەتنىڭ) ئىنتايىن يۇقىرى ئۆتكۈزۈش ئۈنۈمىگە ئېرىشىدىغان سىناقلارلا ئىشلىتىلىدۇ. AAV بىلەن ئايلاندۇرۇلغان ھالقىسى بىر كېچىدىلا تىكلەنگەندىن كېيىن مىكرو پارچىلىنىپ (0.1 M كاكوات بۇففېرىدا %4 PFA ۋە %2.5 گلۇتارالدېھىد) ۋە تېخىمۇ پىششىقلاپ ئىشلەندى. EPON نى كىرگۈزۈش ئۈچۈن، تىكلەنگەن توقۇلما 0.1 M ناترىي كاكوات بۇففېرى (Applichem) بىلەن يۇيۇلۇپ، 0.1 M ناترىي كاكوات بۇففېرىدا %2 OsO4 (os, Science Services; Caco) بىلەن 4 سائەت ئىنكۇباتسىيە قىلىندى، ئاندىن 2 سائەت يۇيۇلدى. 0.1 M كوكامىد بۇففېرى بىلەن 3 قېتىم تەكرارلاندى. كېيىن، ئېتانولنىڭ ئۆرلەش قاتارى ھەر بىر ئېتانول ئېرىتمىسىنى 4 سېلسىيە گرادۇستا 15 مىنۇت ئىنكۇباتسىيە قىلىپ، توقۇلمىلارنى سۇسىزلاندۇردى. توقۇلما پروپىلېن ئوكسىدقا يۆتكىلىپ، 4 سېلسىيە گرادۇستا EPON (Sigma-Aldrich) دا بىر كېچە ئىنكۇباتسىيە قىلىندى. توقۇلمىنى ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 2 سائەت يېڭى EPON غا قويۇپ، ئاندىن 62 سېلسىيە گرادۇستا 72 سائەت قويۇڭ. ئۇلترا مىكروتوم (Leica Microsystems, UC6) ۋە ئالماس پىچاق (Diatome, Biel, Switzerland) ئىشلىتىپ، 70 نانومېتىرلىق ئۇلترا نېپىز پارچىلارنى كېسىپ، 37 سېلسىيە گرادۇستا 15 مىنۇت %1.5 ئۇرانىل ئاتسېتات بىلەن بوياپ، 4 مىنۇت قوغۇشۇن سىترات ئېرىتمىسى بىلەن بوياپ چىقىڭ. ئېلېكترونلۇق مىكروگرافلار Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) ۋە DigitalMicrograph يۇمشاق دېتالى (Gatan) بىلەن تەمىنلەنگەن JEM-2100 Plus ئېلېكترونلۇق مىكروسكوپ (JEOL) ئارقىلىق ئېلىندى. ئانالىز قىلىش ئۈچۈن، 5000 × ياكى 10،000 × رەقەملىك چوڭايتىش ئارقىلىق ئېلېكترونلۇق مىكروگرافلار ئېلىندى.
مىتوخوندىرىيەنىڭ مورفولوگىيەلىك ئانالىزى. بارلىق ئانالىزلاردا، يەككە مىتوخوندىرىيەنىڭ شەكلى ImageJ يۇمشاق دېتالى ئارقىلىق رەقەملىك رەسىملەردە قولدا سىزىلغان. ھەر خىل مورفولوگىيەلىك پارامېتىرلار ئانالىز قىلىنغان. مىتوخوندىرىيە زىچلىقى ھەر بىر ھۈجەيرىنىڭ ئومۇمىي مىتوخوندىرىيە كۆلىمىنى سىتوپلازما كۆلىمىگە بۆلۈش ئارقىلىق ئېرىشكەن پىرسەنت شەكلىدە ئىپادىلىنىدۇ (سىتوپلازما كۆلىمى = ھۈجەيرە كۆلىمى-ھۈجەيرە يادروسى كۆلىمى) ​​× 100. مىتوخوندىرىيەنىڭ يۇمىلاقلىقى [4π∙(مەيدان/پېرىمېتىر 2)] فورمۇلاسى بىلەن ھېسابلىنىدۇ. مىتوخوندىرىيەنىڭ ئىستا مورفولوگىيەسى ئانالىز قىلىنىپ، ئاساسلىق شەكلىگە ئاساسەن ئىككى تۈرگە («قۇۋۇرچاق» ۋە «پوچكا») ئايرىلدى.
ئاپتوفاگوسوما/لىزوسوما سانى ۋە زىچلىق ئانالىزى. رەقەملىك رەسىمدىكى ھەر بىر ئاپتوفاگوسوما/لىزوسومانىڭ شەكلىنى قولدا سىزىش ئۈچۈن ImageJ يۇمشاق دېتالىنى ئىشلىتىڭ. ئاپتوفاگوسوما/لىزوسوما كۆلىمى ھەر بىر ھۈجەيرىنىڭ ئومۇمىي ئاپتوفاگوسوما/لىزوسوما قۇرۇلما كۆلىمىنى سىتوپلازما كۆلىمىگە بۆلۈش ئارقىلىق ھېسابلىنىدۇ (سىتوپلازما كۆلىمى=ھۈجەيرە كۆلىمى-يادرو كۆلىمى)×100. ئاپتوفاگوسوما/لىزوسوما زىچلىقى ئومۇمىي ساننى ھەر بىر ھۈجەيرىدىكى ئاپتوفاگوسوما/لىزوسوما قۇرۇلما سانىغا بۆلۈش ئارقىلىق ھېسابلىنىدۇ (سىتوپلازما كۆلىمى = ھۈجەيرە كۆلىمى-يادرو كۆلىمى).
ئۆتكۈر كېسىش ۋە ئەۋرىشكە تەييارلاش ئۈچۈن بەلگە قويۇش. گىليۇكوزا بەلگىسى قويۇشنى تەلەپ قىلىدىغان تەجرىبىلەر ئۈچۈن، ئۆتكۈر مېڭە پارچىلىرىنى ئالدىن ئىنكۇباتسىيە كامېراسىغا يۆتكىڭ، بۇ كامېرادا تويۇنغان كاربون (95% O2 ۋە 5% CO2)، يۇقىرى Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM ناترىي فوسفات بۇفېر، 25.0 mM NaHCO3، 25.0 mM d-گىليۇكوزا، 1.0 mM CaCl2 ۋە 2.0 mM MgCl2، pH قىممىتى 7.4 ۋە 310 دىن 320 mOsm غىچە تەڭشەلگەن) بار، بۇ كامېرادا گىليۇكوزا 13C6- گىليۇكوزا ئورنىنى ئالىدۇ (Eurisotop، كاتالوگ نومۇرى CLM-1396). پىرۇۋات بەلگىسى قويۇشنى تەلەپ قىلىدىغان تەجرىبىلەر ئۈچۈن، ئۆتكۈر مېڭە پارچىلىرىنى يۇقىرى Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM ناترىي فوسفات بۇفېر، 25.0 mM NaHCO3، 25.0 mM d-گلېكوزا، 1.0 mM CaCl2) غا يۆتكەپ، 2.0 mM MgCl2 قوشۇپ، pH قىممىتىنى 7.4 ۋە 310 دىن 320 mOsm غىچە تەڭشەڭ) ۋە 1 mM 1-[1-13C]پىرۇۋات (Eurisotop، كاتالوگ نومۇرى CLM-1082) قوشۇڭ. پارچىلارنى 37 سېلسىيە گرادۇستا 90 مىنۇت تۇرغۇزۇڭ. تەجرىبىنىڭ ئاخىرىدا، پارچىلار 75 mM ئاممونىي كاربونات تەركىبىدىكى سۇ ئېرىتمىسى (pH 7.4) بىلەن تېز يۇيۇلدى، ئاندىن 40:40:20 (v:v:v) ئاتسېتونىترىل (ACN): مېتانول: سۇدا گوموگېنلاشتۇرۇلدى. پارچىلار مۇز ئۈستىدە 30 مىنۇت تۇرغۇزۇلغاندىن كېيىن، ئەۋرىشكىلەر 21000 گراملىق تېمپېراتۇرىدا 4 سېلسىيە گرادۇستا 10 مىنۇت مەركەزدىن قاچۇرۇلدى، سۈزۈك ئۈستۈنكى سۇيۇقلۇق SpeedVac قويۇقلاشتۇرۇش ئۈسكۈنىسىدە قۇرۇتۇلدى. ھاسىل بولغان قۇرۇتۇلغان مېتابولىت دانچىسى ئانالىز قىلىنغۇچە -80 سېلسىيە گرادۇستا ساقلاندى.
13 دانە C بەلگىسى بار ئامىنو كىسلاتاسىنىڭ سۇيۇق خروماتوگرافىيە-ماسسا سپېكترومېتىرىيە ئانالىزى. سۇيۇق خروماتوگرافىيە-ماسسا سپېكترومېتىرىيەسى (LC-MS) ئانالىزى ئۈچۈن، مېتابولىت دانچىسى 75μl LC-MS دەرىجىلىك سۇدا (Honeywell) قايتا ئېرىتىلدى. 21000 g دا 4°C دا 5 مىنۇت مەركەزدىن قاچۇرۇلغاندىن كېيىن، ئامىنو كىسلاتا ئېقىمى ئانالىزى ئۈچۈن 20μl ئېنىقلانغان ئۈستۈنكى قەۋەت ئىشلىتىلدى، قالغان ئېكىستراكت دەرھال ئانيون ئانالىزى ئۈچۈن ئىشلىتىلدى (تۆۋەنگە قاراڭ). ئامىنو كىسلاتاسى ئانالىزى ئىلگىرى تەسۋىرلەنگەن بېنزوئىل خىلورىد ھاسىل قىلىش قائىدىسى (55، 56) ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى. تۇنجى قەدەمدە، 20μl مېتابولىت ئېكىستراكتىغا 10μl 100 mM ناترىي كاربونات (Sigma-Aldrich) قوشۇلدى، ئاندىن LC دەرىجىلىك ACN غا 10μl 2% لىك بېنزوئىل خىلورىد (Sigma-Aldrich) قوشۇلدى. ئەۋرىشكە قىسقا ۋاقىت ئارىلاشتۇرۇلۇپ، ئاندىن 21000 g دا 20 سېلسىيە گرادۇستا 5 مىنۇت مەركەزدىن قاچۇرۇلدى. تازىلانغان ئۈستۈنكى سۇيۇقلۇقنى كونۇس شەكىللىك ئەينەك قىستۇرمىسى بار 2 مىللىلىتىرلىق ئاپتوماتىك ئۈلگە ئېلىش بوتۇلكىسىغا (200 μl ھەجىمدە) يۆتكىڭ. ئەۋرىشكىلەر Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) يۇقىرى ئېنىقلىقتىكى ئېنىقلىقتىكى ماسسا سپېكترومېتىرىغا (Thermo Fisher Scientific) ئۇلانغان Acquity iClass ئۇلترا يۇقىرى ئىقتىدارلىق LC سىستېمىسى (Waters) ئارقىلىق تەھلىل قىلىندى. تەھلىل قىلىش ئۈچۈن، ھاسىل قىلىنغان ئەۋرىشكىنىڭ 2μl قىسمى 1.8μm زەررىچىلەرنى ئۆز ئىچىگە ئالغان 100×1.0 mm يۇقىرى كۈچلۈك كرېمنىي T3 ئىستونىغا (Waters) قۇيۇلدى. ئېقىم سۈرئىتى 100μl/min بولۇپ، بۇففېر سىستېمىسى بۇففېر A (10 mM ئاممونىي فورمات ۋە سۇدىكى 0.15% فورمىك كىسلاتا) ۋە بۇففېر B (ACN) دىن تەركىب تاپقان. گرادىيېنت تۆۋەندىكىدەك: 0 مىنۇتتا 0%B؛ 0%B. 0 دىن 0.1 مىنۇتقىچە 0 دىن 15% گىچە B؛ 0.1 دىن 0.5 مىنۇتقىچە 15 دىن 17% گىچە B؛ 0.5 دىن 14 مىنۇتقىچە 17 دىن 55% گىچە B؛ 14 دىن 14.5 مىنۇتقىچە 55 دىن 70% گىچە B؛ 18 مىنۇتقىچە 14.5 دىن 70 گىچە 100% B؛ 18 دىن 19 مىنۇتقىچە 100% B؛ 19 دىن 19.1 مىنۇتقىچە 100 دىن 0% B؛ 19.1 دىن 28 مىنۇتقىچە 0% B (55، 56). QE-HF ماسسا سپېكترومېتىرى مۇسبەت ئىئونلىشىش ھالىتىدە، m/z (ماسسا/زارياد نىسبىتى) ئارىلىقىدا 50 دىن 750 گىچە ئىشلەيدۇ. قوللىنىلغان ئېنىقلىق دەرىجىسى 60،000، قولغا كەلتۈرۈلگەن كۈچەيتىش كونترولى (AGC) ئىئون نىشانى 3×106، ئەڭ چوڭ ئىئون ۋاقتى 100 مىللىسېكۇنت. قىزىتىلغان ئېلېكترو پۈركۈش ئىئونلىشىش (ESI) مەنبەسى 3.5 كىلوۋولتلۇق پۈركۈش توك بېسىمى، 250 سېلسىيە گرادۇسلۇق كاپىللا تېمپېراتۇرىسى، 60 AU (خالىغانچە بىرلىك) قاپ ھاۋا ئېقىمى ۋە 20 AU. 250 سېلسىيە گرادۇسلۇق ياردەمچى ھاۋا ئېقىمى بىلەن ئىشلەيدۇ. S لىنزىسى 60 AU غا تەڭشەلگەن.
13C بەلگە قويۇلغان ئورگانىك كىسلاتالارنىڭ ئانيون خروماتوگرافىيەسى-MS ئانالىزى. قالغان مېتابولىت چۆكمىسى (55μl) QE-HF ماسسا سپېكترومېتىرىغا (Thermo Fisher Scientific) ئۇلانغان Dionex ئىئون خروماتوگرافىيە سىستېمىسى (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) ئارقىلىق ئانالىز قىلىندى. قىسقىسى، 5μl مېتابولىت ئېكىستراكتى HPLC (2 mm×250 mm، زەررىچە چوڭلۇقى 4μm، Thermo Fisher Scientific) بىلەن تەمىنلەنگەن Dionex IonPac AS11-HC ئىستونىغا تولدۇرۇلۇپ، تولدۇرۇش نىسبىتى 1 بولغان قىسمەن ھالقىسىمان ھالەتكە كىرگۈزۈلدى.) Dionex IonPac AG11-HC قوغداش ئىستونىغا (2 mm x 50 mm، 4μm، Thermo Fisher Scientific) قۇيۇلدى. ئىستوننىڭ تېمپېراتۇرىسى 30°C دا ساقلىنىدۇ، ئاپتوماتىك ئۈلگە ئېلىش ئۈسكۈنىسى 6°C غا تەڭشەلدى. ئېلۇئېنت گېنېراتورى ئارقىلىق كالىي گىدروكسىد گرادىيېنتىنى ھاسىل قىلىش ئۈچۈن، ئىئونسىزلاشتۇرۇلغان سۇ بىلەن تەمىنلەنگەن كالىي گىدروكسىد كارترىجىنى ئىشلىتىڭ. مېتابولىتلارنى 380μl/min ئېقىم سۈرئىتىدە ئايرىش، تۆۋەندىكى گرادىيېنتنى قوللىنىش: 0 دىن 3 مىنۇتقىچە، 10 mM KOH؛ 3 دىن 12 مىنۇتقىچە، 10 دىن 50 mM KOH؛ 12 دىن 19 مىنۇتقىچە، 50 دىن 100 mM KOH؛ 19 دىن 21 مىنۇتقىچە، 100 mM KOH؛ 21 دىن 21.5 مىنۇتقىچە، 100 دىن 10 mM KOH. تۈۋرۈك 10 mM KOH ئاستىدا 8.5 مىنۇت قايتا تەڭپۇڭلاشتۇرۇلدى.
ئېلىۋېلىنغان مېتابولىتلار تۈۋرۈكتىن كېيىن 150μl/min ئىزوپروپانول قوشۇمچە ئېقىمى بىلەن بىرلەشتۈرۈلۈپ، ئاندىن مەنپىي ئىئونلىشىش ھالىتىدە ئىشلەيدىغان يۇقىرى ئېنىقلىقتىكى ماسسا سپېكترومېتىرىغا يۆتكەلىدۇ. MS ماسسا دائىرىسىنى m/z 50 دىن 750 گىچە بولغان ئارىلىقتا 60،000 ئېنىقلىق بىلەن كۆزىتىۋاتىدۇ. AGC 1×106 غا تەڭشەلدى، ئەڭ چوڭ ئىئون ۋاقتى 100 ms دا ساقلىنىدۇ. قىزىتىلغان ESI مەنبەسى 3.5 kV پۈركۈش توك بېسىمىدا ئىشلەندى. ئىئون مەنبەسىنىڭ باشقا تەڭشەكلىرى تۆۋەندىكىچە: كاپىللا تېمپېراتۇرىسى 275°C؛ قاپاق گاز ئېقىمى 60 AU؛ ياردەمچى گاز ئېقىمى 300°C دا 20 AU ۋە S لىنزىسى 60 AU غا تەڭشەلدى.
13C بەلگە قويۇلغان مېتابولىتلارنىڭ سانلىق مەلۇمات ئانالىزى. ئىزوتوپ نىسبىتىنىڭ سانلىق مەلۇمات ئانالىزى ئۈچۈن TraceFinder يۇمشاق دېتالىنى (4.2 نەشرى، Thermo Fisher Scientific) ئىشلىتىڭ. ھەر بىر بىرىكمىنىڭ كىملىكى ئىشەنچلىك پايدىلىنىش بىرىكمىسى ئارقىلىق دەلىللەندى ۋە مۇستەقىل ئانالىز قىلىندى. ئىزوتوپنى بايىتىش ئانالىزىنى ئېلىپ بېرىش ئۈچۈن، ھەر بىر 13C ئىزوتوپى (Mn) نىڭ ئېلىنغان ئىئون خروماتوگراممىسى (XIC) نىڭ كۆلىمى [M + H]+ دىن ئېلىندى، بۇ يەردە n نىشان بىرىكمىنىڭ كاربون سانى بولۇپ، ئامىنو كىسلاتاسىنى تەھلىل قىلىشقا ئىشلىتىلىدۇ ياكى [MH]+ ئانيونلارنى تەھلىل قىلىشقا ئىشلىتىلىدۇ. XIC نىڭ ماسسا توغرىلىقى مىليوندا بەش قىسىمدىن تۆۋەن، RT نىڭ توغرىلىقى 0.05 مىنۇت. بايىتىش ئانالىزى بايقالغان ھەر بىر ئىزوتوپنىڭ ماس كېلىدىغان بىرىكمىنىڭ بارلىق ئىزوتوپلىرىنىڭ يىغىندىسىغا بولغان نىسبىتىنى ھېسابلاش ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلىدۇ. بۇ نىسبەتلەر ھەر بىر ئىزوتوپ ئۈچۈن پىرسەنت قىممىتى سۈپىتىدە بېرىلىدۇ، نەتىجىلەر ئىلگىرىكى (42) دا بايان قىلىنغاندەك مول پىرسەنت بايىتىش (MPE) سۈپىتىدە ئىپادىلىنىدۇ.
توڭلىتىلغان نېرۋا ھۈجەيرىسىنىڭ دانچىسى مۇزدەك سوغۇق 80% مېتانول (v/v) دا گوموگېنلاشتۇرۇلۇپ، ئايلاندۇرۇلۇپ، -20°C دا 30 مىنۇت تۇرغۇزۇلدى. ئەۋرىشكە يەنە ئايلاندۇرۇلۇپ، +4°C دا 30 مىنۇت ئارىلاشتۇرۇلدى. ئەۋرىشكە 21000 g دا 4°C دا 5 مىنۇت مەركەزدىن قاچۇرۇلدى، ئاندىن ھاسىل بولغان ئۈستۈنكى سۇيۇقلۇق يىغىۋېلىنىپ، كېيىنكى ئانالىز ئۈچۈن 25°C دا SpeedVac قويۇقلاشتۇرۇش ئۈسكۈنىسى ئارقىلىق قۇرۇتۇلدى. يۇقىرىدا بايان قىلىنغاندەك، تۈرگە ئايرىلغان ھۈجەيرىلەرنىڭ ئامىنو كىسلاتاسىدا LC-MS ئانالىزى ئېلىپ بېرىلدى. TraceFinder (4.2 نەشرى، Thermo Fisher Scientific) ئارقىلىق، ھەر بىر بىرىكمىنىڭ مونوئىزوتوپ ماسسىسى ئارقىلىق سانلىق مەلۇمات ئانالىزى ئېلىپ بېرىلدى. مېتابولىت سانلىق مەلۇماتلىرىنىڭ كۋانتىل نورماللاشتۇرۇشى preprocessCore يۇمشاق دېتال بولىقى (57) ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى.
پارچىلارنى تەييارلاش. چاشقانغا تېزلا كاربون تۆت ئوكسىد بىلەن بېھۇش قىلىنىپ، بېشى كېسىۋېتىلدى، مېڭىسى باش سۆڭىكىدىن تېزلا چىقىرىۋېتىلدى، مۇز تولدۇرۇلغان تىترەش پىچىقى (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, گېرمانىيە) بىلەن ئۇنى 300 دىن 375 μm غىچە بولغان ساگىتتال پارچىلارغا كېسىش ئۈچۈن ئىشلىتىلدى. سوغۇق كاربون گازلاشتۇرۇش (95% O2 ۋە 5% CO2) تۆۋەن Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ناترىي فوسفات بۇفېر, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-گلېكوزا, 1.0 mM CaCl2 ۋە 6.0 mM MgCl2 pH قىممىتىنى 7.4 ۋە 310 دىن 330 mOsm غىچە تەڭشەڭ). ئېلىنغان مېڭە پارچىلىرىنى pH قىممىتى 7.4 ۋە 310 دىن 320 mOsm غىچە بولغان يۇقىرى Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM ناترىي فوسفات بۇفېر، 25.0 mM NaHCO3، 25.0 mM d-گلېكوزا، 4.0 mM CaCl2 ۋە mM 3.5 MgCl2) بار كامېراغا يۆتكەڭ. پارچىلارنى خاتىرىلەشتىن بۇرۇن ئەسلىگە كەلتۈرۈش ئۈچۈن 20 مىنۇتتىن 30 مىنۇتقىچە ساقلاڭ.
خاتىرىلەش. بارلىق خاتىرىلەشلەر ئۈچۈن مۇقىم خاتىرىلەش كامېراسى ۋە 20x سۇغا چىلاش ئوبيېكتىپ لىنزىسى (Scientifica) بىلەن تەمىنلەنگەن مىكروسكوپ سەھنىسى ئىشلىتىلدى. پەرەز قىلىنغان پۇركىنجې ھۈجەيرىلىرى (i) بەدەن چوڭلۇقى، (ii) كىچىك مېڭەنىڭ ئاناتومىيىلىك ئورنى ۋە (iii) فلۇئورېسسېنسىيەلىك mtYFP خەۋەرچى گېنىنىڭ ئىپادىلىنىشى ئارقىلىق ئېنىقلاندى. ئۇچىغا قارشىلىق كۆرسىتىش كۈچى 5 دىن 11 مېگومغىچە بولغان ياماق پىپېتكىسى بوروسىلىكات ئەينەك كاپىللارى (GB150-10، 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, گېرمانىيە) ۋە گورىزونتال پىپېتكا Instruments (P-1000, Sutter, Novato, CA) ئارقىلىق چىقىرىۋېتىلدى. بارلىق خاتىرىلەشلەر ELC-03XS npi ياماق قىسقۇچ كۈچەيتكۈچ (npi electronic GmbH, Tam, گېرمانىيە) ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى، بۇ كۈچەيتكۈچ Signal (6.0 نەشرى، Cambridge Electronic, Cambridge, ئەنگىلىيە) تەرىپىدىن كونترول قىلىندى. بۇ تەجرىبە 12.5 kHz ئەۋرىشكە ئېلىش سۈرئىتىدە خاتىرىلەندى. سىگنال ئايرىم-ئايرىم ھالدا 1.3 ۋە 10 kHz كېسىش چاستوتىسى بولغان ئىككى قىسقا ئۆتكۈزگۈچلۈك Bessel فىلتىرى ئارقىلىق سۈزۈلىدۇ. پەردە ۋە پىپېتكىنىڭ سىغىمى كۈچەيتكۈچ ئارقىلىق تولۇقلىما توك يولى ئارقىلىق تولۇقلىنىدۇ. بارلىق سىناقلار Hokawo يۇمشاق دېتالى (2.8 نەشرى، Hamamatsu، Gerden، گېرمانىيە) تەرىپىدىن كونترول قىلىنىدىغان Orca-Flash 4.0 كامېراسى (Hamamatsu، Gerden، گېرمانىيە) نىڭ كونتروللۇقى ئاستىدا ئېلىپ بېرىلدى.
ئادەتتىكى پۈتۈن ھۈجەيرە قۇرۇلمىسى ۋە ئانالىزى. خاتىرىلەشتىن بۇرۇن، پىپېتكىنى تۆۋەندىكى ماددىلارنى ئۆز ئىچىگە ئالغان ئىچكى ئېرىتمە بىلەن تولدۇرۇڭ: 4.0 mM KCl، 2.0 mM NaCl، 0.2 mM EGTA، 135.0 mM كالىي گلۇكونات، 10.0 mM Hepes، 4.0 mM ATP (Mg)، 0.5 mM گۋانوزىن ترىفوسفات (GTP) (Na) ۋە 10.0 mM كرېئاتىن فوسفات pH قىممىتى 7.25 كە تەڭشەلدى، ئوسموس بېسىمى 290 mOsm (ساخاروزا) بولدى. پەردىنى يېرىش ئۈچۈن 0 pA كۈچ ئىشلەتكەندىن كېيىن، دەم ئېلىش پەردىسىنىڭ پوتېنسىيالى ئۆلچەندى. كىرىش قارشىلىقى -40، -30، -20 ۋە -10 pA لىق گىپېرپولىزاتورلۇق توكلارنى قوللىنىش ئارقىلىق ئۆلچەندى. توك بېسىمىنىڭ چوڭلۇقىنى ئۆلچەڭ ۋە كىرىش قارشىلىقىنى ھېسابلاش ئۈچۈن Ohm قانۇنىنى ئىشلىتىڭ. ئۆزلۈكىدىن پەيدا بولغان پائالىيەت توك بېسىمى قىسقۇچتا 5 مىنۇت خاتىرىلەندى، ھەمدە sPSC يېرىم ئاپتوماتىك تونۇش سىكرىپتى ئارقىلىق Igor Pro (32 7.01 نەشرى، WaveMetrics، كۆل ئوسۋېگو، ئورېگون، ئامېرىكا) دا ئېنىقلىنىپ ئۆلچەندى. IV ئەگرى سىزىقى ۋە مۇقىم ھالەتتىكى توك باتارېيەنى ھەر خىل پوتېنسىياللاردا قىسىپ (-110 mV دىن باشلاپ) ۋە توك بېسىمىنى 5 mV قەدەمدە ئاشۇرۇش ئارقىلىق ئۆلچەندى. AP نىڭ ئىشلەپچىقىرىلىشى قۇتۇپسىزلىنىش توكى قوللىنىش ئارقىلىق سىناق قىلىندى. قۇتۇپسىزلىنىش توك ئىمپۇلسىنى قوللىنىش بىلەن بىر ۋاقىتتا، باتارېيەنى -70 mV دا قىسىپ قويۇڭ. ھەر بىر خاتىرىلەش ئۈسكۈنىسىنىڭ قەدەم چوڭلۇقىنى ئايرىم تەڭشەڭ (10 دىن 60 pA غىچە). ئەڭ يۇقىرى AP چاستوتىسىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغان ئىمپۇلس دولقۇنلىرىنى قولدا ساناپ، ئەڭ چوڭ AP چاستوتىسىنى ھېسابلاڭ. AP چېكى بىر ياكى بىردىن ئارتۇق AP نى ئالدى بىلەن قوزغىتىدىغان قۇتۇپسىزلىنىش ئىمپۇلسىنىڭ ئىككىنچى ھاسىلىسى ئارقىلىق تەھلىل قىلىنىدۇ.
تۆشۈكلۈك ياماقنى تەڭشەش ۋە تەھلىل قىلىش. ئۆلچەملىك قائىدىلەرنى ئىشلىتىپ تۆشۈكلۈك ياماق خاتىرىلەش ئېلىپ بېرىڭ. تۆۋەندىكى تەركىبلەرنى ئۆز ئىچىگە ئالمىغان ATP ۋە GTPسىز پىپېتكىنى ئىشلىتىڭ: 128 mM گلۇكونات K، 10 mM KCl، 10 mM Hepes، 0.1 mM EGTA ۋە 2 mM MgCl2 ۋە pH قىممىتىنى 7.2 گە تەڭشەڭ (KOH ئىشلىتىپ). ھۈجەيرە پەردىسىنىڭ كونترول قىلىنمايدىغان ئۆتكۈزۈشچانلىقىنىڭ ئالدىنى ئېلىش ئۈچۈن، ATP ۋە GTP ھۈجەيرە ئىچىدىكى ئېرىتمىدىن چىقىرىۋېتىلىدۇ. ياماق پىپېتكىسى ئامفوتېرىسىن تەركىبلىك ئىچكى ئېرىتمە (تەخمىنەن 200 دىن 250μg/ml غىچە؛ G4888، Sigma-Aldrich) بىلەن تولدۇرۇلىپ، تۆشۈكلۈك ياماق خاتىرىسى ھاسىل قىلىنىدۇ. ئامفوتېرىسىن دىمېتىل سۇلفوكسىدتا ئېرىتىلدى (ئاخىرقى قويۇقلۇقى: 0.1 دىن 0.3% گىچە؛ DMSO؛ D8418، Sigma-Aldrich). ئىشلىتىلگەن DMSO نىڭ قويۇقلۇقى تەتقىق قىلىنغان نېرۋا ھۈجەيرىلىرىگە كۆرۈنەرلىك تەسىر كۆرسەتمىدى. مۇشتلاش جەريانىدا، قانال قارشىلىقى (Ra) ئۈزلۈكسىز كۆزىتىلدى، ھەمدە Ra ۋە AP نىڭ ئامپلىتۇدىسى مۇقىملاشقاندىن كېيىن (20-40 مىنۇت) سىناق باشلاندى. ئۆزلۈكىدىن پەيدا بولغان پائالىيەت توك بېسىمى ۋە/ياكى توك قىسقۇچتا 2 مىنۇتتىن 5 مىنۇتقىچە ئۆلچەندى. سانلىق مەلۇمات ئانالىزى Igor Pro (7.05.2 نەشرى، WaveMetrics، ئامېرىكا)، Excel (2010 نەشرى، Microsoft شىركىتى، Redmond، ئامېرىكا) ۋە GraphPad Prism (8.1.2 نەشرى، GraphPad Software Inc.، La Jolla، CA) ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى. ئۆزلۈكىدىن پەيدا بولغان AP لارنى ئېنىقلاش ئۈچۈن، IgorPro نىڭ NeuroMatic v3.0c قىستۇرمىسى ئىشلىتىلىدۇ. ھەر بىر خاتىرىگە ئايرىم-ئايرىم تەڭشەلگەن بېرىلگەن چەك ئارقىلىق AP لارنى ئاپتوماتىك ئېنىقلاڭ. مۇشتلاش ئارىلىقىنى ئىشلىتىپ، مۇشتلاش چاستوتىسىنى ئەڭ چوڭ دەرھال مۇشتلاش چاستوتىسى ۋە ئوتتۇرىچە مۇشتلاش چاستوتىسى بىلەن بېكىتىڭ.
PN ئايرىش. ئىلگىرى ئېلان قىلىنغان كېلىشىمگە ماسلىشىش ئارقىلىق، PN لار بەلگىلەنگەن باسقۇچتا چاشقان مىڭىسىدىن تازىلاندى (58). قىسقىسى، مىڭە مۇزدەك سوغۇق ئايرىش مۇھىتىدا [HBSS Ca2+ ۋە Mg2+ قوشۇلمىغان، 20 mM گلۇكوزا، پېنىتسىللىن (50 U/ml) ۋە سترېپتومىتسىن (0.05 mg/ml) قوشۇلغان] پارچىلىنىپ، ئۇۋۇلاندى، ئاندىن مۇھىت پاپائىندا ھەزىم قىلىندى [HBSS، 1-سىستېئىن·HCl (1 mg/ml)، پاپائىن (16 U/ml) ۋە دېئوكسىرىبونۇكلېئازا I (DNase I; 0.1 mg/ml) قوشۇلغان]. 30 سېلسىيە گرادۇستا 30 مىنۇت داۋالاندى. ئالدى بىلەن توقۇلمىلارنى تۇخۇم شىلىمشىقى (10 mg/ml)، BSA (10 mg/ml) ۋە DNase (0.1 mg/ml) بار HBSS مۇھىتىدا ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا يۇيۇپ، ئېنزىملىق ھەزىم قىلىشنىڭ ئالدىنى ئېلىڭ، ئاندىن 20 mM گىليۇكوزا بار HBSS مۇھىتىدا HBSS، پېنىتسىللىن (50 U/ml)، سترېپتومىتسىن (0.05 mg/ml) ۋە DNase (0.1 mg/ml) دا ئاستا ئۇۋىلاپ، يەككە ھۈجەيرىلەرنى قويۇپ بېرىڭ. ھاسىل بولغان ھۈجەيرە سۇسپېنزىيەسى 70 μm لىق ھۈجەيرە سۈزگۈچتىن سۈزۈلدى، ئاندىن ھۈجەيرىلەر مەركەزدىن قاچۇرۇش (1110 rpm, 5 مىنۇت, 4°C) ئارقىلىق پارچىلىنىپ، ئايرىش مۇھىتىدا قايتا سۇسپېنزىيە قىلىندى [HBSS، 20 mM گىليۇكوزا، 20% ھامىلە كالا قان زەردابى، پېنىتسىللىن (50 U/ml) ۋە سترېپتومىتسىن (0.05 mg/ml) قوشۇلغان]؛ پروپىدىي يودىد بىلەن ھۈجەيرىنىڭ ياشاش ئىقتىدارىنى باھالاڭ ۋە ھۈجەيرە زىچلىقىنى 1×106 دىن 2×106 ھۈجەيرە/ml غىچە تەڭشەڭ. ئېقىم سىتومېتىرىيەسىدىن ئىلگىرى، سۇسپېنزىيە 50 مىكرومېتىرلىق ھۈجەيرە سۈزگۈچ ئارقىلىق سۈزۈلدى.
ئېقىن سىتومېتىرى. ھۈجەيرە تۈرگە ئايرىش FACSAria III ماشىنىسى (BD Biosciences) ۋە FACSDiva يۇمشاق دېتالى (BD Biosciences، 8.0.1 نەشرى) ئارقىلىق 4 سېلسىيە گرادۇستا ئېلىپ بېرىلدى. ھۈجەيرە سۇسپېنزىيەسى 100 μm لىق نوزۇر ئارقىلىق 20 psi بېسىم ئاستىدا ~2800 ۋەقە/سېكۇند سۈرئىتىدە تۈرگە ئايرىلدى. ئەنئەنىۋى دەرۋازا ئۆلچىمى (ھۈجەيرە چوڭلۇقى، قوش موداللىق پەرقلەندۈرۈش ۋە تارقىلىش خۇسۇسىيىتى) PN نى باشقا ھۈجەيرە تىپلىرىدىن توغرا ئايرىۋېتىشكە كاپالەتلىك قىلالمىغاچقا، دەرۋازا ئىستراتېگىيىسى mitoYFP+ ​​​​ۋە كونترول mitoYFP − چاشقانلىرىدىكى YFP كۈچلۈكلۈكى ۋە ئاپتوماتىك فلۇئورېسسېنسىيەنى بىۋاسىتە سېلىشتۇرۇش ئاساسىدا بېكىتىلىدۇ. YFP 488 nm لازېر لىنىيىسى بىلەن ئەۋرىشكە نۇرى بىلەن قوزغىتىلىدۇ، سىگنال 530/30 nm لېنتا ئۆتكۈزۈش فىلتىرى ئارقىلىق بايقىلىدۇ. mitoYFP+ ​​چاشقانلىرىدا، Rosa26-mitoYFP خەۋەرچى گېنىنىڭ نىسپىي كۈچى نېرۋا ھۈجەيرىسى تېنى ۋە ئاكسون پارچىلىرىنى پەرقلەندۈرۈشكىمۇ ئىشلىتىلىدۇ. 7-AAD 561 nm سېرىق لازېر بىلەن قوزغىتىلىدۇ ۋە ئۆلۈك ھۈجەيرىلەرنى چىقىرىۋېتىش ئۈچۈن 675/20 nm لىق بەلۋاغ ئۆتكۈزۈش فىلتىرى بىلەن بايقىلىدۇ. بىرلا ۋاقىتتا ئاستروسىتلارنى ئايرىش ئۈچۈن، ھۈجەيرە سۇسپېنزىيەسى ACSA-2-APC بىلەن بويالغان، ئاندىن ئەۋرىشكە 640 nm لىق لازېر سىزىقى بىلەن نۇرلاندۇرۇلغان ۋە سىگنالنى بايقاش ئۈچۈن 660/20 nm لىق بەلۋاغ ئۆتكۈزۈش فىلتىرى ئىشلىتىلگەن.
توپلانغان ھۈجەيرىلەر مەركەزدىن قاچۇرۇش ئارقىلىق پارچىلىنىپ (1110 ئايلىنىش/مىنۇت، 5 مىنۇت، 4 سېلسىيە گرادۇس) ئىشلىتىلىپ، -80 سېلسىيە گرادۇسلۇق تېمپېراتۇرىدا ئىشلىتىلدى. Mfn2cKO چاشقانلىرى ۋە ئۇلارنىڭ بالىلىرى تەرتىپ ئۆزگىرىشچانلىقىنى ئەڭ تۆۋەن چەككە چۈشۈرۈش ئۈچۈن ئوخشاش كۈندە تۈرگە ئايرىلدى. FACS سانلىق مەلۇماتلىرىنى كۆرسىتىش ۋە تەھلىل قىلىش FlowJo يۇمشاق دېتالى (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA) ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى.
يۇقىرىدا دېيىلگەندەك (59)، ھەقىقىي ۋاقىتلىق PCR كېيىنكى mtDNA مىقدارىنى ئېنىقلاش ئۈچۈن تۈرگە ئايرىلغان نېرۋا ھۈجەيرىلىرىدىن DNA نى ئايرىۋېلىشقا ئىشلىتىلىدۇ. سىزىقلىق ۋە چەك سەزگۈرلۈكى دەسلەپتە ھەر خىل ساندىكى ھۈجەيرىلەردە qPCR ئىجرا قىلىش ئارقىلىق سىناق قىلىندى. قىسقىسى، 50 mM tris-HCl (pH 8.5)، 1 mM EDTA، 0.5% Tween 20 ۋە پروتېئىنازا K (200 ng/ml) دىن تەركىب تاپقان ئېرىتىش بۇفېرىغا 300 PN توپلاپ، 55°C دا 120 مىنۇت ئىنكۇباتسىيە قىلىڭ. پروتېئىنازا K نىڭ تولۇق ئاكتىپسىزلىنىشىغا كاپالەتلىك قىلىش ئۈچۈن ھۈجەيرىلەر 95°C دا 10 مىنۇت ئىنكۇباتسىيە قىلىندى. mt-Nd1 غا خاس TaqMan زوندى (Thermo Fisher) ئىشلىتىپ، mtDNA 7900HT ھەقىقىي ۋاقىتلىق PCR سىستېمىسىدا (Thermo Fisher Scientific) يېرىم مىقدارلىق PCR ئارقىلىق ئۆلچەندى. Science، كاتالوگ نومۇرى Mm04225274_s1)، mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific، كاتالوگ نومۇرى AIVI3E8) ۋە 18S (Thermo Fisher Scientific، كاتالوگ نومۇرى Hs99999901_s1) گېنلىرى.
ئاقسىل ئەۋرىشكىسىنى تەييارلاش. ئېرىتمىنى 95 سېلسىيە گرادۇستا 10 مىنۇت قىزىتىپ، ئۇلترا ئاۋاز دولقۇنى ئارقىلىق ئېرىتمە بۇفېرىدا [6 M گۋانىدىن خىلورىد، 10 mM ترىس(2-كاربوكسىئېتىل) فوسفىن گىدروخلورىد، 10 mM خىلوراتسېتامىد ۋە 100 mM ترىس- HCl دىكى مۇزلىتىلغان نېرۋا ھۈجەيرىسىنى لىزىسلاشتۇرۇڭ]. بىئورۇپتوردا (دىئاگېنود) 10 مىنۇت (30 سېكۇنت ئىمپۇلس / 30 سېكۇنت توختاپ قېلىش مەزگىلى) ئېلىپ بېرىلدى. ئەۋرىشكە 20 mM ترىس-HCl (pH 8.0) دا 1:10 سۇيۇلدۇرۇلۇپ، 300 ng ترىپسىن ئالتۇن (Promega) بىلەن ئارىلاشتۇرۇلۇپ، تولۇق ھەزىم قىلىنىش ئۈچۈن 37 سېلسىيە گرادۇستا بىر كېچە تۇرغۇزۇلدى. ئىككىنچى كۈنى، ئەۋرىشكە 20،000 g دا 20 مىنۇت مەركەزدىن قاچۇرۇلدى. ئۈستۈنكى سۇيۇقلۇق %0.1 فورمىك كىسلاتا بىلەن سۇيۇلدۇرۇلدى، ۋە ئېرىتمە ئۆزى ياسىغان StageTips بىلەن تۇزسىزلاندۇرۇلدى. بۇ ئەۋرىشكە SpeedVac ئەسۋابىدا (Eppendorf قويۇقلاشتۇرۇش ماشىنىسى ۋە 5305) 45 سېلسىيە گرادۇستا قۇرۇتۇلغان، ئاندىن پېپتىد %0.1 فورمىك كىسلاتادا سۇسلاشتۇرۇلغان. بارلىق ئەۋرىشكىلەر بىرلا ۋاقىتتا ئوخشاش بىر ئادەم تەرىپىدىن تەييارلانغان. ئاستروسىت ئەۋرىشكىلىرىنى تەھلىل قىلىش ئۈچۈن، 4 μg تۇزسىزلاندۇرۇلغان پېپتىدلارغا پېپتىدنىڭ TMT رېئاكتىپىغا بولغان نىسبىتى 1:20 بولغان تەڭدەم ماسسا بەلگىسى (TMT10plex، كاتالوگ نومۇرى 90110، Thermo Fisher Scientific) قويۇلغان. TMT بەلگىسى قويۇش ئۈچۈن، 0.8 مىللىگرام TMT رېئاكتىپى 70 μl سۇسىز ACN غا قايتا ئېرىتىلگەن ۋە قۇرۇتۇلغان پېپتىد 9 μl 0.1 M TEAB (تىرىئېتىلاممونىي بىكاربونات) غا قايتا ئارىلاشتۇرۇلغان، ئۇنىڭغا ACN دىكى 7 μl TMT رېئاكتىپى قوشۇلغان. قويۇقلۇقى %43.75 بولغان. 60 مىنۇتلۇق ئىنكۇباتسىيەدىن كېيىن، رېئاكسىيە 2 μl %5 گىدروكسىلامىن بىلەن ئۆچۈرۈلدى. بەلگە قويۇلغان پېپتىدلار يىغىۋېلىنىپ، قۇرۇتۇلۇپ، 200 μl %0.1 فورمىك كىسلاتا (FA) دا قايتا ئېرىتىلىپ، ئىككىگە بۆلۈندى، ئاندىن ئۆزى ياسىغان StageTips ئارقىلىق تۇزسىزلاندۇرۇلدى. UltiMate 3000 ئۇلترا يۇقىرى ئىقتىدارلىق سۇيۇقلۇق خروماتوگرافى (UltiMate 3000 ئۇلترا يۇقىرى ئىقتىدارلىق سۇيۇقلۇق خروماتوگرافى) ئارقىلىق، ئىككى يېرىمنىڭ بىرى 130Å1.7μm C18 زەررىچىلىرى (Waters، كاتالوگ نومۇرى SKU: 186006935) بىلەن تولدۇرۇلغان 1mm x 150mm Acquity خروماتوگرافىيە تۈۋرۈكىدە پارچىلاندى. Thermo Fisher Scientific). پېپتىدلارنى 30μl/min ئېقىم سۈرئىتىدە ئايرىڭ، %1 دىن %50 گىچە بولغان بۇففېر B نى 85 مىنۇت ئايرىڭ، باسقۇچلۇق گرادىيېنت 96 مىنۇت، %50 دىن %95 گىچە بولغان بۇففېر B نى 3 مىنۇت، ئاندىن %95 بۇففېر B ئۈچۈن 8 مىنۇت ئايرىڭ؛ بۇففېر A %5 ACN ۋە 10 mM ئاممونىي بىكاربونات (ABC)، بۇففېر B %80 ACN ۋە 10 mM ABC دىن تەركىب تاپقان. ھەر 3 مىنۇتتا كەسىرلەرنى يىغىپ، ئۇلارنى ئىككى گۇرۇپپىغا (1 + 17، 2 + 18 قاتارلىقلار) بىرلەشتۈرۈپ، ۋاكۇئۇم سانترىفۇگدا قۇرۇتۇڭ.
LC-MS/MS ئانالىزى. ماسسا سپېكترومېتىرىيەسى ئۈچۈن، پېپتىدلار (n119.aq نومۇرى) 25 سانتىمېتىر، 75 μm ئىچكى دىئامېتىرلىق PicoFrit ئانالىز تۈۋرۈكىدە (يېڭى ئوبيېكتىپ لىنزا، بۆلەك نومۇرى PF7508250) 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ ئوتتۇرا (Dr. Maisch, mat)، Use EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, گېرمانىيە) بىلەن تەمىنلەنگەن ھالدا ئايرىلدى. تۈۋرۈك 50 سېلسىيە گرادۇستا ساقلاندى. A ۋە B بۇففېرلىرى ئايرىم-ئايرىم ھالدا سۇدا %0.1 فورمىك كىسلاتا ۋە %80 ACN دا %0.1 فورمىك كىسلاتادىن تەركىب تاپقان. پېپتىدلار %6 دىن %31 گىچە بولغان بۇففېر B دىن 65 مىنۇت ۋە %31 دىن %50 گىچە بولغان بۇففېر B دىن 5 مىنۇت 200 nl/min گرادۇسلۇق ئايرىلدى. ئېلىۋېلىنغان پېپتىدلار Orbitrap Fusion ماسسا سپېكترومېتىرىدا (Thermo Fisher Scientific) تەھلىل قىلىندى. پېپتىدنىڭ ئالدىنقى قىسمى m/z ئۆلچەش 350 دىن 1500 m/z غىچە بولغان ئارىلىقتا 120،000 ئېنىقلىق بىلەن ئېلىپ بېرىلدى. %27 نورماللاشتۇرۇلغان سوقۇلۇش ئېنېرگىيەسى ئارقىلىق، يۇقىرى ئېنېرگىيەلىك C تۇزاق ئايرىش (HCD) پارچىلىنىشى ئۈچۈن 2 دىن 6 گىچە بولغان ئەڭ كۈچلۈك ئالدىنقى قىسىم تاللاندى. دەۋرىيلىك ۋاقىت 1 سېكۇنتقا تەڭشەلدى. پېپتىد پارچىسىنىڭ m/z قىممىتى ئىئون تۇزاقتا ئەڭ كىچىك AGC نىشانى 5×104 ۋە ئەڭ چوڭ كىرگۈزۈش ۋاقتى 86 ms ئارقىلىق ئۆلچەندى. پارچىلانغاندىن كېيىن، ئالدىنقى قىسىم 45 سېكۇنت دىنامىك چىقىرىۋېتىش تىزىملىكىگە كىرگۈزۈلدى. TMT بەلگىسى قويۇلغان پېپتىدلار 50 سانتىمېتىر، 75 μm Acclaim PepMap ئىستونىدا (Thermo Fisher Scientific، كاتالوگ نومۇرى 164942) ئايرىلدى، كۆچۈش سپېكترى يۇقىرى مەيدانلىق ئاسسىمېترىك دولقۇن شەكىللىك ئىئونلار (FAIMS) ئۈسكۈنىسى (Thermo Fisher Scientific) بىلەن تەمىنلەنگەن Orbitrap Lumos Tribrid ماسسا سپېكترومېتىرىدا (Thermo Fisher Scientific) تەھلىل قىلىندى، ئۇ −50 ۋە −70 V ئىككى خىل تولۇقلىما توك بېسىمىدا ئىشلەيدۇ. TMT دوكلاتىنىڭ ئىئون سىگنالىنى ئۆلچەش ئۈچۈن سىنخرونلاشتۇرۇش ئالدىنقى قىسمىغا ئاساسەن تاللانغان MS3 ئىشلىتىلىدۇ. پېپتىد ئايرىش EASY-nLC 1200 دا ئېلىپ بېرىلدى، %90 سىزىقلىق گرادىيېنت ئېلۇتسىيەسى قوللىنىلدى، بۇففېر قويۇقلۇقى %6 تىن %31 گىچە؛ بۇففېر A %0.1 FA، بۇففېر B %0.1 FA ۋە %80 ACN ئىدى. ئانالىز ئىستون 50°C تېمپېراتۇرىدا ئىشلەيدۇ. ئەسلى ھۆججەتنى FAIMS تولۇقلىما توك بېسىمىغا ئاساسەن بۆلۈش ئۈچۈن FreeStyle (1.6 نەشرى، Thermo Fisher Scientific) نى ئىشلىتىڭ.
ئاقسىلنى ئېنىقلاش ۋە مىقدارلاشتۇرۇش. ئاندرومېدا ئىزدەش ماتورى ئارقىلىق، دەسلەپكى سانلىق مەلۇماتلار MaxQuant نىڭ 1.5.2.8 نەشرى (https://maxquant.org/) ئارقىلىق تەھلىل قىلىندى. Aequorea victoria دىن ئېلىنغان Cre recombinaza ۋە YFP تەرتىپلىرىدىن باشقا، پېپتىد پارچىسى سپېكترىدىن چاشقان پايدىلىنىش پروتېئومىنىڭ (Proteome ID UP000000589، 2017-يىلى 5-ئايدا UniProt دىن چۈشۈرۈلدى) كانونىك تەرتىپ ۋە ئىزوفورم تەرتىپى ئىزدىنىلدى. مېتىئونىن ئوكسىدلىنىشى ۋە ئاقسىل N-تېرمىنال ئاتسېتىللىنىشى ئۆزگەرگۈچى مىقداردا ئۆزگەرتىلدى؛ سىستېئىن كارباموئىل مېتىللىنىشى بەلگىلەنگەن مىقداردا ئۆزگەرتىلدى. ھەزىم قىلىش پارامېتىرلىرى «ئۆزگىچە» ۋە «تىرىپسىن/P» غا تەڭشەلدى. ئاقسىلنى ئېنىقلاش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدىغان پېپتىد ۋە ئۇستىرا پېپتىدلىرىنىڭ ئەڭ ئاز سانى 1؛ ئۆزگىچە پېپتىدلارنىڭ ئەڭ ئاز سانى 0. پېپتىد خەرىتىسىنى ماسلاشتۇرۇش شەرتى ئاستىدا، ئاقسىلنى ئېنىقلاش نىسبىتى 0.01 بولدى. «ئىككىنچى پېپتىد» تاللانمىسى قوزغىتىلدى. «ئىجرا قىلىش ئارىلىقىدىكى ماسلىشىش» تاللانمىسىنى ئىشلىتىپ، مۇۋەپپەقىيەتلىك ئېنىقلاشلارنى ئوخشىمىغان ئەسلى ھۆججەتلەر ئارىسىدا يۆتكىڭ. بەلگەسىز مىقدارلاشتۇرۇش (LFQ) ئۈچۈن LFQ ئەڭ تۆۋەن نىسبەت سانى 1 نى ئىشلىتىڭ (60). LFQ كۈچلۈكلۈكى ھەر ۋاقىت نۇقتىسىدا كەم دېگەندە بىر گېنوتىپ گۇرۇپپىسىدىكى كەم دېگەندە ئىككى كۈچكە ئىگە قىممەت ئۈچۈن سۈزۈلىدۇ، ھەمدە كەڭلىكى 0.3 بولغان نورمال تەقسىملىنىشتىن چىقىرىلىدۇ ۋە 1.8 تۆۋەنگە يۆتكىلىدۇ. LFQ نەتىجىلىرىنى تەھلىل قىلىش ئۈچۈن Perseus ھېسابلاش سۇپىسى (https://maxquant.net/perseus/) ۋە R (https://r-project.org/) نى ئىشلىتىڭ. limma يۇمشاق دېتال بولىقىدىن ئېلىنغان ئىككى تەرەپلىك ئوتتۇراھال t سىنىقى پەرقلىق ئىپادىلەش ئانالىزى ئۈچۈن ئىشلىتىلدى (61). تەكشۈرۈش سانلىق مەلۇمات ئانالىزى ggplot، FactoMineR، factoextra، GGally ۋە pheatmap ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلىدۇ. TMT ئاساسلىق پروتېئومىكا سانلىق مەلۇماتلىرى MaxQuant نىڭ 1.6.10.43 نەشرى ئارقىلىق تەھلىل قىلىندى. UniProt نىڭ 2018-يىلى سېنتەبىردە چۈشۈرۈلگەن ئىنسان پروتېئومىكىسى سانلىق مەلۇمات ئامبىرىدىن خام پروتېئومىكا سانلىق مەلۇماتلىرىنى ئىزدەڭ. بۇ ئانالىز ئىشلەپچىقارغۇچى تەمىنلىگەن ئىزوتوپ ساپلىقىنى تۈزىتىش كوئېففىتسېنتىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ. پەرقلىق ئىپادىلەش ئانالىزى ئۈچۈن R دىكى limma نى ئىشلىتىڭ. ئەسلى سانلىق مەلۇماتلار، سانلىق مەلۇمات ئامبىرى ئىزدەش نەتىجىلىرى ۋە سانلىق مەلۇمات ئانالىزى خىزمەت ئېقىمى ۋە نەتىجىلىرىنىڭ ھەممىسى PRIDE ھەمراھ ئامبىرى ئارقىلىق ProteomeXchange ئىتتىپاقىدا سانلىق مەلۇمات توپلىمى ئېنىقلىغۇچ PXD019690 بىلەن ساقلىنىدۇ.
فۇنكسىيەلىك ئىزاھاتلار ئانالىزنى بېيىتىدۇ. 8 ھەپتىلىك سانلىق مەلۇماتلار توپلىمىنىڭ فۇنكسىيەلىك ئىزاھات شەرتلىرىنىڭ موللۇقىنى بېكىتىش ئۈچۈن Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) قورالى ئىشلىتىلدى (1-رەسىم). قىسقىسى، LC-MS/MS (tandem mass spectrometry) سانلىق مەلۇمات ئانالىزىدىن ئېرىشكەن مىقدارلىق ئاقسىل تىزىملىكى تۆۋەندىكى سۈزگۈچ ئۆلچىمى بىلەن ئىشلىتىلىدۇ: Mus musculus تۈر ۋە ئارقا كۆرۈنۈش سۈپىتىدە تاللىنىدۇ، ھەمدە بۇ تۈر Benjaminini تەرىپىدىن 0.05 ياكى ئۇنىڭدىن تۆۋەن بايىتىش ئۈچۈن تەڭشەلگەن P قىممىتىنىڭ مۇھىم دەپ قارىلىدىغانلىقىنى كۆرسىتىدۇ. بۇ گىرافىك ئۈچۈن، تەڭشەلگەن P قىممىتىگە ئاساسەن ھەر بىر توپلامدىكى ئالدىنقى بەش ئارتۇق تۈر كۆرسىتىلدى. Benjaminini، Krieger ۋە Yekutieli (Q = 5%) نىڭ ئىككى باسقۇچلۇق سىزىقلىق كۈچەيتىش پروگراممىسىنى ئىشلىتىپ، كۆپ t سىنىقى ئارقىلىق، ھەر بىر تۈردىكى مۇھىم كاندىداتلارغا ۋاقىت ئېقىمى ئاقسىلىنىڭ ئىپادىلىنىش ئانالىزى ئېلىپ بېرىلىدۇ، ھەمدە ھەر بىر قۇر ئايرىم تەھلىل قىلىنىدۇ. ئىزچىل SD قوللىنىشنىڭ ھاجىتى يوق.
بۇ تەتقىقاتنىڭ نەتىجىلىرىنى ئېلان قىلىنغان سانلىق مەلۇمات ئامبىرى بىلەن سېلىشتۇرۇش ۋە 1-رەسىمدىكى ۋېنن دىئاگراممىسىنى ھاسىل قىلىش ئۈچۈن، بىز مىقدارلىق ئاقسىل تىزىملىكىنى MitoCarta 2.0 ئىزاھاتلىرى بىلەن بىرلەشتۈردۇق (24). دىئاگراممىنى ھاسىل قىلىش ئۈچۈن تور قورالى Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) نى ئىشلىتىڭ.
پروتېئومىكا ئانالىزىدا ئىشلىتىلىدىغان ستاتىستىكىلىق تەرتىپلەر توغرىسىدىكى تەپسىلىي ئۇچۇرلار ئۈچۈن، ماتېرىياللار ۋە ئۇسۇللار بۆلۈمىگە قاراڭ. باشقا بارلىق تەجرىبىلەر ئۈچۈن، تەپسىلىي ئۇچۇرلارنى مۇناسىۋەتلىك رىۋايەتتىن تاپقىلى بولىدۇ. باشقىچە بەلگىلىمە بولمىسا، بارلىق سانلىق مەلۇماتلار ئوتتۇرىچە قىممەت ± SEM شەكلىدە ئىپادىلىنىدۇ، ھەمدە بارلىق ستاتىستىكىلىق ئانالىزلار GraphPad Prism 8.1.2 يۇمشاق دېتالى ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى.
بۇ ماقالىگە ئائىت قوشۇمچە ماتېرىياللار ئۈچۈن، http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 غا قاراڭ.
بۇ Creative Commons Attribution-Non-Commercial License شەرتلىرى بويىچە تارقىتىلغان ئوچۇق كىرىشلىك ماقالە بولۇپ، ئاخىرقى ئىشلىتىش سودا مەقسىتىدە بولمىغان ۋە ئەسلى ئەسەرنىڭ توغرا بولۇشى شەرت قىلىنغان ئەھۋالدا ھەر قانداق ۋاسىتە ئارقىلىق ئىشلىتىشكە، تارقىتىشقا ۋە كۆپەيتىشكە يول قويۇلىدۇ. پايدىلىنىش ئۈچۈن پايدىلىنىڭ.
ئەسكەرتىش: بىز پەقەت ئېلخەت ئادرېسىڭىزنى بېرىشىڭىزنى تەلەپ قىلىمىز، شۇنداق بولغاندا بەتكە تەۋسىيە قىلغان كىشى ئېلخەتنى كۆرۈشنى خالايدىغانلىقىڭىزنى ۋە ئۇنىڭ ئەخلەت ئەمەسلىكىنى بىلىدۇ. بىز ھېچقانداق ئېلخەت ئادرېسىنى خاتىرىلىمەيمىز.
بۇ سوئال سىزنىڭ زىيارەتچى ئىكەنلىكىڭىزنى سىناش ۋە ئاپتوماتىك ھالدا ئەخلەت ئۇچۇر يوللاشنىڭ ئالدىنى ئېلىش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدۇ.
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
نورمالسىز نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنىڭ پروتېئومىكا ئانالىزى شۇنى كۆرسەتتىكى، ماددا ئالمىشىش پروگراممىلىرى نېرۋا چېكىنىشىنىڭ ئالدىنى ئېلىش ئۈچۈن ئاكتىپلىنىدۇ.
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
نورمالسىز نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنىڭ پروتېئومىكا ئانالىزى شۇنى كۆرسەتتىكى، ماددا ئالمىشىش پروگراممىلىرى نېرۋا چېكىنىشىنىڭ ئالدىنى ئېلىش ئۈچۈن ئاكتىپلىنىدۇ.
© 2020 ئامېرىكا ئىلىم-پەننى ئىلگىرى سۈرۈش جەمئىيىتى. بارلىق ھوقۇقلار قوغدىلىدۇ. AAAS بولسا HINARI ، AGORA ، OARE ، CHORUS ، CLOCKSS ، CrossRef ۋە COUNTER نىڭ ھەمكارلاشقۇچىسى. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.