ھازىرقى ئادرېسى: OX11 0DE، ئەنگىلىيە، Diamond بىناسى، Harwell پەن-تېخنىكا ۋە يېڭىلىق يارىتىش باغچىسى، Dietcote، Oxfordshire، ئەنگىلىيە، Diamond Light Source شىركىتى، ئېلېكترونلۇق بىئولوگىيىلىك سۈرەت مەركىزى.
رېئاكسىيە مەركىزى نۇر يىغىش بىرىكمىسى 1 (RC-LH1) بىنەپشە رەڭلىك فوتوتروفىك باكتېرىيەنىڭ يادرولۇق فوتوسىنتېز تەركىبىي قىسمى. بىز Rhodopseudomonas palustris دىن ئېلىنغان RC-LH1 بىرىكمىسىنىڭ ئىككى توڭلىتىلغان ئېلېكترون مىكروسكوپ قۇرۇلمىسىنى كىرگۈزدۇق. RC-LH114-W بىرىكمىسىنىڭ 2.65-Å ئېنىقلىقتىكى قۇرۇلمىسى RC نى ئوراپ تۇرىدىغان 14 تارماق LH1 ھالقىسىدىن تەركىب تاپقان بولۇپ، بۇ ھالقىلار ئاقسىل W تەرىپىدىن ئۈزۈلۈپ قالىدۇ، ئاقسىل-W بولمىغان بىرىكمە بولسا پۈتۈنلەي RC تەركىبى بىلەن ئوراپ تۇرىدۇ. 16 تارماق LH1 ھالقىسى يېپىق. بۇ قۇرۇلمىلارنى سېلىشتۇرۇش RC-LH1 بىرىكمىسىدىكى خىنوننىڭ دىنامىكىسىنى، جۈملىدىن RC QB ئورنىدا خىنون بىلەن باغلىنىشتىكى ئىلگىرى ئېنىقلانمىغان كونفوراتسىيە ئۆزگىرىشلىرىنى، شۇنداقلا ئۇلارنىڭ RC غا ئۆتۈشىگە ياردەم بېرىدىغان ياردەمچى خىنون باغلىنىش ئورۇنلىرىنىڭ ئورنىنى چۈشىنىشكە ياردەم بېرىدۇ. W ئاقسىلىنىڭ ئۆزگىچە قۇرۇلمىسى LH1 ھالقىسىنىڭ تاقىلىشىنىڭ ئالدىنى ئېلىپ، خىنون/خىنون ئالمىشىشىنى تېزلىتىش ئۈچۈن يول يارىتىدۇ.
فوتوسىنتېز تەمىنلىگەن ئېنېرگىيە يەر شارىدىكى دېگۈدەك بارلىق جانلىقلارنى ساقلاپ قالالايدۇ، ھەمدە قۇياش بىئوتېخنىكا ساھەسىدە زور يوشۇرۇن كۈچكە ئىگە. بىنەپشە رەڭلىك فوتوتروفىك باكتېرىيەلەر دۇنياۋى فوتوسىنتېزنى ئىلگىرى سۈرۈش بىلەن بىرگە، ھەر خىل ئېنېرگىيە ھالىتى ۋە ماددا ئالمىشىش ئىقتىدارىنى نامايان قىلىدۇ. ئۇلار فوتوسىنتېزدىن ساقلىنىپ، قاراڭغۇدا ھېتېروتروفىك باكتېرىيە سۈپىتىدە ئۆسەلەيدۇ، ئازوت ۋە كاربون تۆت ئوكسىدنى تۈزەلەيدۇ، ھىدروگېن ئىشلەپچىقىرالايدۇ ۋە خۇشپۇراق بىرىكمىلەرنى پارچىلىيالايدۇ (1-3). بۇ جەريانلارغا ئېنېرگىيە بىلەن تەمىنلەش ئۈچۈن، نۇر تېز ۋە ئۈنۈملۈك ھالدا خىمىيىلىك ئېنېرگىيەگە ئايلىنىشى كېرەك. بۇ جەريان نۇرنى تۇتۇۋالىدىغان ئانتېننا بىرىكمىسى نۇرنى سۈمۈرۈپ، تۇتۇۋېلىنغان ئېنېرگىيەنى رېئاكسىيە مەركىزىگە (RC) يۆتكىگەندە باشلىنىدۇ، شۇنىڭ بىلەن زەرەت ئايرىلىشى باشلىنىدۇ (4-7). بىنەپشە رەڭلىك فوتوتروفىك باكتېرىيەلەردىكى فوتوسىنتېزنىڭ ئاساسىي بىرلىكى 2-تىپلىق RC دىن تەركىب تاپقان بولۇپ، ئۇنىڭ ئەتراپى نۇر يىغىۋالىدىغان بىرىكمە 1 (LH1) بىلەن قورشالغان بولۇپ، RC-LH1 يادرولۇق بىرىكمىسىنى شەكىللەندۈرىدۇ. LH1 بىر قاتار ئەگرى αβ ھېتېرودىمېرلىرى تەرىپىدىن شەكىللىنىدۇ، بۇلارنىڭ ھەر بىرى ئىككى باكتېرىيە خىلوروفىل (BChl) a مولېكۇلاسى ۋە بىر ياكى ئىككى كاروتىنوئىد (8-12) بىلەن باغلىنىدۇ. ئەڭ ئاددىي LH1 ئانتېنناسى RC (9-13) نى يېپىق ھالقا ئىچىدە ئوراپ تۇرىدىغان 16 ياكى 17 αβ ھېتېرودىمېردىن تەركىب تاپقان، ئەمما باشقا يادرولۇق بىرىكمىلەردە، ترانسمېبران پېپتىدلىرى ئەتراپىدىكى LH1 نىڭ داۋاملىقلىقىنى ئۈزۈپ، RC بىلەن سىتوخروم bc1 بىرىكمىسى ئوتتۇرىسىدىكى كىنول/خىنون تارقىلىشىنى ئىلگىرى سۈرىدۇ (11، 13-15). بىنەپشە رەڭلىك فوتوتروفىك ئۆسۈملۈك Rhodopseudomonas (Rps.) فوتوسىنتېزنى قوللايدىغان ئېنېرگىيە ۋە ئېلېكترون يۆتكىلىشىنى چۈشىنەلەيدىغان مودېل ئورگانىزم. Rps نىڭ تۇنجى كىرىستال قۇرۇلمىسى. palustris RC-LH1 بىرىكمىسىنىڭ مودېلى RC بولۇپ، ئۇنىڭ ئەتراپى 15 ھېتېرودىمېرلىق LH1 ھالقىسى بولۇپ، بۇ ھالقىلار «ئاقسىل W» دەپ ئاتىلىدىغان نامەلۇم ئاقسىل تەرىپىدىن ئۈزۈلىدۇ (14). كېيىن ئاقسىل-W RPA4402 دەپ ئېنىقلاندى، بۇ ئۈچ خىل ئالدىن پەرەز قىلىنغان ترانسمېبران سىپرال (TMH) بار بولغان خاراكتېرى ئېنىقلانمىغان 10.5kDa ئاقسىل (16). بىز RC-L، M (pufL، pufM) ۋە LH1α، β (pufA، pufB) تارماق بىرلىكلىرىنى كودلايدىغان گېنلارغا ئىشلىتىلىدىغان نام بىلەن ماسلىشىش ئۈچۈن، W ئاقسىلىنى كودلايدىغان rpa4402 گېنىنىڭ نامىنى pufW غا ئۆزگەرتىشنى تەكلىپ قىلىمىز. قىزىقارلىقى شۇكى، W ئاقسىلى RC-LH1 نىڭ پەقەت %10 ىدە مەۋجۇت بولۇپ، Rps. palustris ئىككى خىل RC-LH1 مۇرەككەپ ماددىسىنى ئىشلەپچىقىرىدىغانلىقىنى ئاشكارىلىدى. بۇ يەردە، بىز ئىككى يادرولۇق مۇرەككەپ ماددىنىڭ يۇقىرى ئېنىقلىقتىكى cryo-EM (cryo-EM) قۇرۇلمىسىنى دوكلات قىلىمىز، بىرى W ئاقسىلى ۋە 14 αβ ھېتېرودىمېرلىق، يەنە بىرى W ئاقسىلى ۋە يېپىق 16 ھېتېرودىمېرلىق LH1 ھالقىسىسىز. بىزنىڭ قۇرۇلمىسىمىز Rps. palustris نىڭ RC-LH1 مۇرەككەپ ماددىسىنى چۈشىنىشتىكى باسقۇچلۇق ئۆزگىرىشنى ئىپادىلەيدۇ، چۈنكى بىز ھەر بىر ۋارىيانتنىڭ بىردەك توپىنى تەھلىل قىلدۇق ۋە ھەر بىر پېپتىد ۋە باغلىنىشلىق پىگمېنتلار ۋە مۇناسىۋەتلىك لىپىدلار ۋە خىنونلارنى ئېنىق بېكىتىشكە يېتەرلىك ئېنىقلىققا ئىگە. بۇ قۇرۇلمىلارنى سېلىشتۇرۇش شۇنى كۆرسىتىپ بېرىدۇكى، ھازىرغىچە باشقا ھېچقانداق RC-LH1 بىرىكمىسىدە تېپىلمىغان ئۈچ TMH ئاقسىلى-W نىڭ كىنون/كىنونول ئالماشتۇرۇشنى تېزلىتىش ئۈچۈن بىر كىنون قانىلى ھاسىل قىلىدىغانلىقى مەلۇم بولدى. بىر قاتار ساقلانغان ماي ۋە كىنون باغلىنىش ئورۇنلىرى ئېنىقلاندى، ھەمدە بىز كىنون ۋە RC بىرىكمىسىدىن كېيىن يېڭى بىر كونفوراتسىيە ئۆزگىرىشىنى بايقىدۇق، بۇ ئوكسىگېنلىق فوتوتروفىك ئورگانىزملارنىڭ فوتوسىستېما II (PSII) RC غا ماس كېلىشى مۇمكىن. بىزنىڭ بايقاشلىرىمىز بىنەپشە رەڭلىك فوتوتروفىك باكتېرىيەنىڭ RC-LH1 يادرولۇق بىرىكمىسىدىكى كىنون/كىنونولون باغلىنىش ۋە ئالماشتۇرۇشنىڭ كىنېتىكىسىغا يېڭى چۈشەنچىلەرنى بېرىدۇ.
Rps. palustris دا بايقالغان ئىككى خىل مۇرەككەپ ماددىنىڭ تەپسىلىي تەتقىقاتىنى ئاسانلاشتۇرۇش ئۈچۈن، بىز ھەر بىر RC-LH1 نى بىئوخىمىيىلىك ئۇسۇللار بىلەن ئايرىۋالدۇق. ئاقسىل W كەمچىل مۇرەككەپ ماددىسى (تۆۋەندە ΔpufW دەپ ئاتىلىدۇ) pufW گېنى يوق تۈردىن تازىلاندى (16)، ۋە پەقەت بىرلا RC-LH1 مۇرەككەپ ماددىسىنى ئىشلەپچىقىرىشقا بولىدۇ. ئاقسىل W تەركىبىدىكى مۇرەككەپ ماددىنى بىر تۈر ئىشلەپچىقىرىدۇ. بۇ تۈردىكى ئاقسىل W نىڭ C ئۇچىدا 10x His بەلگىسى بىلەن ئۆزگەرتىلىدۇ، شۇڭا ئاقسىل W تەركىبىدىكى مۇرەككەپ ماددىنى مېتالنى ھەرىكەتسىزلەندۈرۈش ئارقىلىق كۆپىنچە كەمچىل ئاقسىل W بىلەن ئۈنۈملۈك بىرلەشتۈرگىلى بولىدۇ. مۇرەككەپ ماددىنى ئۈنۈملۈك ئايرىۋالدۇق (16) يېقىنلىق خروماتوگرافىيەسى (IMAC).
1-رەسىمدە كۆرسىتىلگەندەك، ھەر ئىككى مۇرەككەپ ماددىنىڭ ئۈچ تارماق RC (RC-L، RC-M ۋە RC-H) بار بولۇپ، LH1 ئانتېنناسى بىلەن ئورالغان. ئاقسىل-W يوق مۇرەككەپ ماددىنىڭ 2.80-A قۇرۇلمىسىدا 16 αβ ھېتېرودىمېر بار بولۇپ، RC نى پۈتۈنلەي ئوراپ تۇرىدىغان يېپىق LH1 ھالقىسىنى شەكىللەندۈرىدۇ، بۇ ھالقا RC نى پۈتۈنلەي ئوراپ تۇرىدۇ، بۇ ھالقا RC-LH116 مۇرەككەپ ماددىسى دەپ ئاتىلىدۇ. ئاقسىل-W تەركىبىدىكى مۇرەككەپ ماددىنىڭ 2.65Å قۇرۇلمىسىدا ئاقسىل-W تەرىپىدىن ئۈزۈلگەن 14 ھېتېرودىمېر LH1 بار، بۇ ھالقا RC-LH114-W دەپ ئاتىلىدۇ.
(A ۋە B) بىرىكمىنىڭ يۈزەكى ئىپادىسى. (C ۋە D) تاياقچە شەكلىدە ئىپادىلەنگەن باغلىنىشلىق پىگمېنتلار. (E ۋە F) سىتوپلازما يۈزىدىن كۆزىتىلگەن بىرىكمىلەر كارتوندا كۆرسىتىلگەن پېپتىدلار ۋە LH1 تارماق بىرلىكلىرىگە ئىگە بولۇپ، ئاقسىل-W بوشلۇقىدىن سائەت يۆنىلىشى بويىچە نومۇرلىنىدۇ [Rba نومۇرىغا ماس كېلىدۇ. sphaeroides complex (13)]. LH1-α ئۈچۈن، ئاقسىل تارماق بىرلىكىنىڭ رەڭگى سېرىق؛ LH1-β ئۈچۈن، ئاقسىل تارماق بىرلىكىنىڭ رەڭگى كۆك؛ ئاقسىل-W ئۈچۈن، ئاقسىل قىزىل؛ RC-H ئۈچۈن، كۆك رەڭ؛ RC-L ئۈچۈن، ئاپېلسىن رەڭ؛ RC-M ئۈچۈن، قىزىل رەڭ. كوفاكتورلار تاياقچە شەكلىدە، يېشىل رەڭ BChl ۋە BPh a مولېكۇلاسىنى، بىنەپشە رەڭ كاروتىنوئىدنى، سېرىق رەڭ UQ10 مولېكۇلاسىنى كۆرسىتىدۇ. (G ۋە H) RC-LH114-W بىرىكمىسى (G) ۋە RC-LH116 بىرىكمىسى (H) نىڭ تەڭداش رايونىدىكى ئاقسىل-W بوشلۇقىنىڭ چوڭايتىلغان كۆرۈنۈشى. كوفاكتورلار بوشلۇقنى تولدۇرۇش شەكلىدە كۆرسىتىلىدۇ، خېلاتلانغان خىنون كۆك رەڭدە كۆرسىتىلىدۇ. ئاقسىل-W بوشلۇقى (G) دا كۆك رەڭلىك ئۈزۈك سىزىق بىلەن، خىنون/خىنولولنىڭ LH116 ھالقىسىغا تارقىلىدىغان كىچىك تۆشۈكلەر (H) دا قارا رەڭلىك ئۈزۈك سىزىق بىلەن كۆرسىتىلىدۇ.
1-رەسىمدە (A ۋە B) LH1αβ گېتېرودىمېرلىرىنىڭ ئوچۇق ياكى يېپىق قاتارلىرى بىلەن قورشالغان RC كۆرسىتىلگەن بولۇپ، بۇلارنىڭ ھەر بىرى ئىككى BChl ۋە بىر كاروتېنوئىد بىلەن باغلىنىدۇ (1-رەسىم، C ۋە D). ئىلگىرىكى تەتقىقاتلار Rps نىڭ LH1 بىرىكمىسى ئىكەنلىكىنى كۆرسەتتى. سىپىرۇلىنا كىسانتىننىڭ بىئوسىنتېزلىق يولىدا، بۇ تۈرلەردە كاروتېنوئىدلارنىڭ ئارىلاشما توپلىرى بار (17). قانداقلا بولمىسۇن، سىپىروپىرروكسانتىن ئاساسلىق كاروتېنوئىد بولۇپ، ئۇنىڭ زىچلىقى قانائەتلىنەرلىك. شۇڭا، بىز بارلىق LH1 باغلىنىش ئورۇنلىرىدا سىپىروكسانتىننى مودېللاشتۇرۇشنى تاللىدۇق. ئالفا ۋە بېتا پولىپېپتىدلىرى قىسقا پەردە سىرتقى رايونلىرىغا ئىگە يەككە TMH (1-رەسىم، A، B، E ۋە F). C ئۇچىدىكى 17 قالدۇقنىڭ زىچلىقى كۆزىتىلمىگەن بولسىمۇ، ئالفا پولىپېپتىد ھەر ئىككى بىرىكمىدە Met1 دىن Ala46 غىچە پارچىلانغان. RC-LH116 دا β پولىپېپتىد Gly4 دىن Tyr52 گىچە، RC-LH114-W دا Ser5 دىن Tyr52 گىچە تۆۋەنلىگەن. 3 ياكى 4 N-تېرمىنال ياكى 13 C-تېرمىنال قالدۇقىنىڭ زىچلىقى كۆزىتىلمىگەن (S1-رەسىم). ياۋا تىپتىكى تۈردىن تەييارلانغان ئارىلاش RC-LH1 بىرىكمىسىنىڭ ماسسا سپېكترومېتىرىيە ئانالىزى نەتىجىسىدە، يوقاپ كەتكەن رايوننىڭ بۇ پېپتىدلارنىڭ ھېتېرولوگىيەلىك پارچىلىنىشىنىڭ نەتىجىسى ئىكەنلىكى كۆرسىتىلدى (S1 ۋە S2-رەسىم). α-Met1 نىڭ N-تېرمىنال شەكىللىنىشىمۇ كۆزىتىلگەن (f). ئانالىز نەتىجىسىدە، α-پېپتىدنىڭ fMet1 دىن Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 گىچە بولغان قالدۇقلاردىن تەركىب تاپقانلىقى، β-پېپتىدنىڭ بولسا Ser2 دىن Ala53 گىچە بولغان قالدۇقلاردىن تەركىب تاپقانلىقى، بۇ تۆۋەن تېمپېراتۇرالىق EM زىچلىق خەرىتىسىگە ماس كېلىدىغانلىقى كۆرسىتىلدى.
α-His29 ۋە β-His36 نىڭ ماسلىشىشى BChls نى يۈز تۇرانە قىلىدۇ؛ ھەر بىر αβ گېتېرودىمېر قوشنىلىرى بىلەن بىرلىشىپ، RC نىڭ ئەتراپىدا ئوچۇق ھالقىنى (RC-LH114-W) ياكى يېپىق ھالقىنى (RC-LH116) ھاسىل قىلىدۇ (1-رەسىم، C ۋە D). RC-LH114-W نىڭ 877 nm بەلبېغى بىلەن سېلىشتۇرغاندا، RC-LH116 نىڭ 880 nm يۇتۇش قىزىل يۆتكىلىشى 3 nm (2A-رەسىم). قانداقلا بولمىسۇن، ئايلانما دىخروئىزم سپېكتىرى دېگۈدەك ئوخشاش (2B-رەسىم)، بۇ ئوچۇق ۋە يېپىق ھالقىلار ئارىسىدا روشەن پەرق بولسىمۇ، BChls نىڭ يەرلىك مۇھىتىنىڭ ئىنتايىن ئوخشاش ئىكەنلىكىنى كۆرسىتىدۇ. يۇتۇش قىزىل يۆتكىلىشى يېپىق ھالقىدىكى ئىسسىقلىق ھەرىكىتىنىڭ ئازىيىشى ۋە مۇقىملىقىنىڭ ئېشىشىنىڭ نەتىجىسى بولۇشى مۇمكىن (18، 19)، يېپىق ھالقىنىڭ كەلتۈرۈپ چىقارغان پىگمېنت باغلىنىشىنىڭ ئۆزگىرىشى (20، 21) ياكى بۇ ئىككى تەسىرنىڭ بىرىكمىسىنىڭ نەتىجىسى بولۇشى مۇمكىن (11).
(A) ئۇلترابىنەفشە نۇر/كۆرۈنۈشچان/يېقىن ئىنفىرا قىزىل نۇر يۇتۇش سپېكتىرى، ئۇنىڭ چوققىلىرى ماس كېلىدىغان پىگمېنتلار بىلەن بەلگىلىنىپ، 775 نانومېتىردىكى BPh چوققىسىغا نورماللاشتۇرۇلغان. (B) 805 نانومېتىردىكى BChl يۇتۇش سپېكتىرىغا نورماللاشتۇرۇلغان ئايلانما دىخروىزم سپېكتىرى. (C ۋە D) RC-LH114-W بىرىكمىسى (C) ۋە RC-LH116 بىرىكمىسى (D) نىڭ ۋاقىت بويىچە ئېنىقلانغان يۇتۇش سپېكتىرىدىن تاللانغان ΔA سپېكتىرى. تېخىمۇ ياخشى سېلىشتۇرۇش ئۈچۈن، بارلىق سپېكتىرلار 0.2 ps دا −A نىڭ ∆A غا نورماللاشتۇرۇلغان. (E) UQ2 نىڭ ھەر خىل قويۇقلۇقىدا نۇرلاندۇرۇلغاندىن كېيىنكى سىتوخروم c2 ئوكسىدلىنىش سۈرئىتى (خام سانلىق مەلۇماتلار ئۈچۈن S8-رەسىمگە قاراڭ). (F) تۆۋەن، ئوتتۇرا ياكى يۇقىرى كۈچلۈك نۇر ئاستىدا ئۆستۈرۈلگەن ھۈجەيرىلەردە (ئايرىم-ئايرىم ھالدا 10، 30 ياكى 300μMm-2 s-1)، تازىلانغان بىرىكمەدىكى ئاقسىل W ۋە RC-L تارماق بىرلىكلىرى ۋە ئايرىلغان پەردە نىسبىتى. SDS-پولىئاكرىلامىد گېلى ئېلېكتروفورېزى ۋە ئىممۇنىتېت ئانالىزى ئارقىلىق ئاقسىل سەۋىيەسىنى بېكىتىڭ (خام سانلىق مەلۇماتلار ئۈچۈن S9-رەسىمگە قاراڭ). تازىلانغان RC-LH114-W بىرىكمىسىگە بولغان نىسبەتنى بېكىتىڭ. بىرىكمىنىڭ RC-L نىڭ ئاقسىل-W غا بولغان ستېخىئومېتىرىيەلىك نىسبىتى 1:1.
RC-LH114-W نىڭ دېفورماتسىيەلەنگەن αβ14 ھالقىسىدىكى 1-ئورۇندىكى BChls (1-رەسىم، A، C ۋە E) RC دەسلەپكى بەرگۈچىگە (P) RC-LH116 دىكى تەڭ BChls غا قارىغاندا 6.8Å يېقىن (1-رەسىم، B، D ۋە F، ۋە S3-رەسىم); قانداقلا بولمىسۇن، ئىككى خىل مۇرەككەپ ماددىنىڭ ۋاقىتلىق يۇتۇش كىنېتىكىسى RC-LH114-W ۋە RC-LH116 ئۈچۈن، LH1 دىن RC غىچە بولغان قوزغىتىش ئېنېرگىيەسى يۆتكەش ۋاقتى تۇراقلىقىنىڭ 40 ±4 ۋە 44 ±3 ps ئىكەنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ (2-رەسىم). ، C ۋە D، S4-رەسىم ۋە S2-جەدۋەل). RC ئىچىدىكى ئېلېكترونلۇق يۆتكەشتىمۇ مۇھىم پەرق يوق (S5-رەسىم ۋە مۇناسىۋەتلىك قوشۇمچە تېكىست). بىز LH1 بىلەن RC-P ئوتتۇرىسىدىكى ئېنېرگىيە يۆتكەش ۋاقتىنىڭ يېقىن ماسلىشىشىنىڭ ئىككى LH1 ھالقىسىدىكى كۆپىنچە BChl نىڭ ئارىلىقى، بۇلۇڭى ۋە پوتېنسىيال ئېنېرگىيەسىنىڭ ئوخشاش بولۇشىدىن كېلىپ چىققان دەپ گۇمان قىلىمىز. LH1 ئېنېرگىيە ئەندىزىسىنى تەكشۈرۈش ئارقىلىق ئەڭ تۆۋەن ئارىلىققا يېتىش ئېنېرگىيەنى بىۋاسىتە ئەڭ ياخشى بولمىغان ئورۇنلاردىن RC غا يۆتكەشتىن تېز ئەمەستەك قىلىدۇ. RC-LH114-W دىكى ئوچۇق ھالقىلىق LH1 ھالقىسى قۇرۇلما ئانالىزى ئۈچۈن تۆۋەن تېمپېراتۇرا شارائىتىدا ئەھمىيەتسىز ئىسسىقلىق ھەرىكىتىگە دۇچ كېلىشى مۇمكىن، ھەمدە RC 1 ئورنىدىكى βBChls نىڭ پىگمېنتلىشىش ئارىلىقىدىن ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا ئۇزۇنراق αβ14 ھالقىسى شەكىللىنىشى بار.
RC-LH116 بىرىكمىسى 32 BChls ۋە 16 كاروتىنوئىدنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ، ئۇنىڭ ئومۇمىي قۇرۇلمىسى Thermochromatium (Tch.) pidpidum [ئاقسىل سانلىق مەلۇمات ئامبىرى (PDB) ID 5Y5S] (9)، Thiorhodovibrio (Trv.) 970 تۈرى (PDB ID 7C9R) (12) ۋە يېشىل يۈسۈن (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) دىن ئېلىنغان بىلەن ئوخشاش. ماسلاشتۇرۇلغاندىن كېيىن، αβ ھېتېرودىمېرلىرىنىڭ ئورنىدا پەقەت كىچىككىنە ئۆزگىرىشلەر كۆزىتىلدى، بولۇپمۇ 1-5، 15 ۋە 16 (S6-رەسىم). ئاقسىل-W نىڭ مەۋجۇتلۇقى LH1 نىڭ قۇرۇلمىسىغا زور تەسىر كۆرسىتىدۇ. ئۇنىڭ ئۈچ TMH قىسقا ھالقىلار ئارقىلىق تۇتاشتۇرۇلغان بولۇپ، N-تېرمىنالى بىرىكمىنىڭ لۇمېن تەرىپىدە، C-تېرمىنالى سىتوپلازما تەرىپىدە (1A ۋە 3-رەسىملەر، A دىن D غىچە). ئاقسىل-W ئاساسەن سۇدىن قورقىدۇ (3B-رەسىم)، TMH2 ۋە TMH3 LH1αβ-14 بىلەن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىپ، پەردە ئارقىلىق يۈز ھاسىل قىلىدۇ (3-رەسىم، B ۋە E دىن G غىچە). چېگرا ئاساسلىقى پەردە ئارقىلىق يۈز بېرىدىغان رايوندىكى Phe، Leu ۋە Val قالدۇقلىرىدىن تەركىب تاپقان. بۇ قالدۇقلار سۇدىن قورقىدىغان ئامىنو كىسلاتاسى ۋە αβ-14 پىگمېنتلىرى بىلەن قاپلانغان. بەزى قۇتۇپ قالدۇقلىرىمۇ ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىشكە تۆھپە قوشىدۇ، بۇنىڭ ئىچىدە مۇرەككەپ بوشلۇقنىڭ يۈزىدىكى W-Thr68 بىلەن β-Trp42 ئوتتۇرىسىدىكى ھىدروگېن باغلىنىشى بار (3-رەسىم، F ۋە G). سىتوپلازما يۈزىدە، Gln34 αβ-14 كاروتېنوئىدلىرىنىڭ كېتو گۇرۇپپىسىغا يېقىن. بۇنىڭدىن باشقا، n-دودېتسىل β-d-مالتوزىد (β-DDM) مولېكۇلاسى ئېرىپ كەتكەن، ئۇنىڭ سۇدىن قورقىدىغان قۇيرۇقى ئاقسىل-W بىلەن αβ-14 ئارىسىدىكى چېگراغا سوزۇلغان، ھەمدە ماي ​​قۇيرۇقى بەدەندە بولۇشى مۇمكىن. بىز يەنە ئاقسىل W ۋە RCH نىڭ C-تېرمىنال ئېنىقلىق رايونلىرىنىڭ ناھايىتى يېقىن ئىكەنلىكىنى، ئەمما ئالاھىدە ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىش دائىرىسىگە كىرمەيدىغانلىقىنى بايقىدۇق (1-رەسىم، A ۋە E). قانداقلا بولمىسۇن، بۇ ئىككى ئاقسىلنىڭ ھەل قىلىنمىغان C-تېرمىنال ئامىنو كىسلاتاسىدا ئۆز-ئارا تەسىر بولۇشى مۇمكىن، بۇ RC-LH114-W بىرىكمىسىنى يىغىش جەريانىدا ئاقسىل-W نىڭ قوبۇل قىلىنىشى ئۈچۈن بىر مېخانىزم بىلەن تەمىنلىشى مۇمكىن.
(A) كارتون شەكلىدە LH1αβ14 بىلەن چەكمە يۈزىگە قارىغان ئاقسىل-W نىڭ تاياقچە شەكىللىك يان زەنجىرى (قىزىل) بار بولۇپ، ئۇ ئېلېكتروستاتىك پوتېنسىيال دىئاگراممىسىنىڭ بىر قىسمىدا كۆرسىتىلىدۇ (شاففاف كۈلرەڭ يۈز، كونتۇر دەرىجىسى 0.13). (B) ئاقسىل-W نىڭ سۇدىن قورقىدىغان رەڭلىك يۈز بىلەن ئىپادىلىنىشى. قۇتۇپ ۋە زەرەتلەنگەن رايونلار كۆك رەڭدە، سۇدىن قورقىدىغان رايونلار ئاق رەڭدە، كۈچلۈك سۇدىن قورقىدىغان رايونلار ئاپېلسىن رەڭدە كۆرسىتىلىدۇ. (C ۋە D) كارتوندا كۆرسىتىلگەن ئاقسىل-W نىڭ يۆنىلىشى (A) (C) دىكى بىلەن ئوخشاش بولۇپ، 180° (D) غا ئايلانغان. تەرتىپتىكى ئورۇنغا ئاساسەن، پەرقلەندۈرگىلى بولىدىغان قالدۇقلار قوس قوڭۇر رەڭ لايىھەسىنى قوللىنىدۇ، بۇ يەردە N-ئۇچى كۆك، C-ئۇچى قىزىل. (E) (A) دىكى بىلەن ئوخشاش كۆرۈنۈشتىكى ئاقسىل-W، ئاقسىل-W:LH1 نىڭ چەكمە يۈزىدىكى قالدۇقلار بەلگىسى چاپلانغان تاياقچە بىلەن ئىپادىلىنىدۇ. (F) كارتون كۆرۈنۈشىدە ئاقسىل-W (E) ۋە LH1αβ14 گە نىسبەتەن 90 گرادۇسقا، بالداق كۆرۈنۈشىدە بولسا ئارا يۈز قالدۇقلىرىغا نىسبەتەن ئايلاندۇرۇلغان. بېتا پولىپېپتىدتىن چىققان ئېشىپ كەتكەن قالدۇقلار بەلگە قويۇلغان. بىرلىكتە ئىشلەيدىغان ئامىل 1-رەسىمدىكى رەڭگە ماس كېلىدىغان بالداق شەكلىدە، پارچىلانغان β-DDM كۈلرەڭ رەڭدە، ئوكسىگېن قىزىل رەڭدە كۆرسىتىلگەن. (G) (F) دىكى كۆرۈنۈش 180 گرادۇسقا ئايلاندۇرۇلغان بولۇپ، بەلگە قويۇلغان ئالفا پولىپېپتىدنىڭ كۆرۈنەرلىك قالدۇقلىرى كۆرۈنىدۇ.
Protein-W αβ گېتېرودىمېرنىڭ (1F-رەسىمدىكى 15-نومۇرلۇق) ئورنىنى ئالىدۇ، شۇنىڭ بىلەن ھالقىنىڭ تاقىلىشىنىڭ ۋە دەسلەپكى ئۈچ αβ گېتېرودىمېرنىڭ ئېگىلىشىنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ. بىرىنچى αβ-1 گېتېرودىمېرنىڭ پەردە نورمالىغا نىسبەتەن ئەڭ چوڭ ئېگىلىش بۇلۇڭى 25° دىن 29° گىچە ئىكەنلىكى كۆزىتىلدى (1-رەسىم، A ۋە E)، بۇ RC A ئۆتكۈر كونتراستلىق-LH116 دىكى αβ-1 نىڭ 2° دىن 8° گىچە ئېگىلىشى بىلەن شەكىللەنگەن (1-رەسىم، B ۋە F). ئىككىنچى ۋە ئۈچىنچى گېتېرودىمېرلار ئايرىم-ئايرىم ھالدا 12° دىن 22° گىچە ۋە 5° دىن 10° گىچە ئېگىلىشلىك. RC نىڭ ستېرىك توسالغۇسى سەۋەبىدىن، αβ-1 نىڭ ئېگىلىشى ئىككىنچى جۈپ αβ نى ئۆز ئىچىگە ئالمايدۇ (بۇ 1F-رەسىمدىكى 16-αβ غا ماس كېلىدۇ)، شۇڭا LH1 ھالقىسىدا ئېنىق بوشلۇق ھاسىل قىلىدۇ (1-رەسىم، A ۋە E). ئىككى αβ ھېتېرودىمېرنىڭ كەمچىل بولۇشى، شۇنىڭ بىلەن بىرگە تۆت BChl ۋە ئىككى كاروتېنوئىدنىڭ يوقىلىشى سەۋەبىدىن، كاروتېنوئىدلارنىڭ ھېچقايسىسى بۇرمىلانغان αβ-1 تارماق بىرلىكىگە باغلانمايدۇ، نەتىجىدە 13 كاروتېنوئىد Vegetarian ۋە 28 BChls نى ئۆز ئىچىگە ئالغان LH114-W ھالقىسى ھاسىل بولىدۇ. αβ1 دىن 7 گىچە بولغان رايونلاردىكى ئىككى مۇرەككەپ بىرىكمىنىڭ يەرلىك ئېنىقلىق مۆلچەرى LH1 ھالقىسىنىڭ قالغان قىسمىدىكىدىن تۆۋەن، بۇ RC QB ئورنىغا يېقىن LH1 تارماق بىرلىكىنىڭ ئۆزىگە خاس سۇلياۋلىقىنى ئەكىس ئەتتۈرۈشى مۇمكىن (4-رەسىم).
RC-LH114-W (A ۋە B) ۋە RC-LH116 (C ۋە D) نىڭ رەسىملىرى 1-رەسىمدىكى (B ۋە D) ئوخشاش ئۈستۈنكى كۆرۈنۈش/يان كۆرۈنۈش (A ۋە B) (A ۋە C) ۋە بوشلۇق يۈزىدىن كۆرسىتىلدى. رەڭلىك كۇنۇپكىلار ئوڭ تەرەپتە كۆرسىتىلدى.
ستېخىئومېتىرىيەلىك نىسبىتى 1:14 بولغان بىردىنبىر خاراكتېرلىق يادرو بىرىكمىسى Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX دىمېرى (13). قانداقلا بولمىسۇن، W ئاقسىلى ۋە PufX نىڭ روشەن گومولوگىيىسى يوق، ھەمدە ئۇلارنىڭ ئايرىم-ئايرىم LH1 قۇرۇلمىسىغا زور تەسىر كۆرسىتىدۇ. PufX بولسا N-تېرمىنال سىتوپلازما رايونىغا ئىگە يەككە TMH بولۇپ، ئۇ RC-H تارماق بىرلىكىنىڭ (13) سىتوپلازما تەرىپى بىلەن Rps. palustris LH116αβ-16 غا ماس كېلىدىغان ئورۇندا ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىدۇ. PufX RC-LH1 بىلەن سىتوخروم bcl بىرىكمىسى ئوتتۇرىسىدا خىنون/خىنولون ئالماشتۇرۇش ئۈچۈن بىر يول ھاسىل قىلىدۇ ۋە بارلىق Rba. sphaeroides يادرو بىرىكمىسىدە مەۋجۇت (13). مونومېر-مونومېر چېگرىسى Rba دا بولسىمۇ. RC-LH1-PufX دىمېرى سفېروئىدلىرى RC-LH114-W دىكى W ئاقسىلىنىڭ باغلىنىش ئورنىدا، PufX ۋە W ئاقسىلى تەرىپىدىن پەيدا قىلىنغان بوشلۇق ئوخشاش ئورۇندا (S7A-رەسىم). RC-LH114-W دىكى بوشلۇق يەنە Pseudomonas rosea LH1 نىڭ پەرەز قىلىنغان خىنون قانىلى (8) بىلەن ماسلىشىدۇ، بۇ قانال W ئاقسىلى ياكى PufX بىلەن مۇناسىۋەتسىز پېپتىدلار تەرىپىدىن ھاسىل قىلىنىدۇ (S7B-رەسىم). بۇنىڭدىن باشقا، Blc دىكى خىنون قانىلى. بىر γ تارماق بىرلىكىنى چىقىرىۋېتىش ئارقىلىق ھاسىل بولغان زۇمرەت يېشىل LH1 ئوخشاش ئورۇندا تۇرىدۇ (S7C-رەسىم). ھەر خىل ئاقسىللار ئارقىلىق ۋاسىتىچىلىك قىلىنسىمۇ، بۇ خىنون/خىنولول قاناللىرىنىڭ RC-LH1 مۇرەككەپ بىرىكمىسىدە ئورتاق ئورۇندا پەيدا بولۇشى يىغىلىشچان تەرەققىياتنىڭ مىسالى بولۇپ، W ئاقسىلى تەرىپىدىن ھاسىل قىلىنغان بوشلۇقنىڭ خىنون قانىلى رولىنى ئوينايدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
LH114-W ھالقىسىدىكى بوشلۇق، ئاقسىللاردىكىگە ئوخشاش ئاقسىل تۆشۈكى ئارقىلىق ئىككى ساھەنى تۇتاشتۇرۇشنىڭ ئورنىغا، RC-LH114-W مۇرەككەپ ماددىسى بىلەن چوڭ پەردە ئارىسىدا ئۈزلۈكسىز پەردە رايونىنىڭ شەكىللىنىشىگە يول قويىدۇ (1G-رەسىم). RC-LH116 مۇرەككەپ ماددىسى يېپىق Tch. ئىگنىسىمان مۇرەككەپ ماددىغا ئوخشايدۇ (22) (1H-رەسىم). خىنوننىڭ پەردە ئارقىلىق تار ئاقسىل قانىلى ئارقىلىق تارقىلىشىدىن تېز بولغاچقا، ئوچۇق LH114-W ھالقىسى يېپىق LH116 ھالقىسىغا قارىغاندا تېزرەك RC ئايلىنىشىغا يول قويالايدۇ، ھەمدە خىنوننىڭ RC غا تارقىلىشى تېخىمۇ چەكلىنىشى مۇمكىن. W ئاقسىلىنىڭ خىنونلارنىڭ RC ئارقىلىق ئايلىنىشىغا تەسىر كۆرسىتىدىغان-تەسىر قىلمايدىغانلىقىنى تەكشۈرۈش ئۈچۈن، بىز بەلگىلىك قويۇقلۇقتىكى ئۇبىكىنون 2 (UQ2) (قىسقا ئىزوپرېن قۇيرۇقلۇق تەبىئىي UQ10 نىڭ ئوخشىتىشى) ئۈستىدە سىتوخروم ئوكسىدلىنىش سىنىقى ئېلىپ باردۇق (2E-رەسىم). گەرچە خىلاتلانغان خىنوننىڭ مەۋجۇتلۇقى مىكايلىس تۇراقلىقىنى توغرا بېكىتىشكە توسقۇنلۇق قىلسىمۇ (RC-LH114-W ۋە RC-LH116 ئايرىم-ئايرىم ھالدا 0.2±0.1μM ۋە 0.5±0.2μM غا ماس كېلىدۇ)، RC-LH114-W نىڭ ئەڭ يۇقىرى سۈرئىتى (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) RC-LH116 دىن (3.6±0.1 e-RC-1 s-1) %28±5 چوڭ.
بىز دەسلەپتە ئاقسىل-W نىڭ يادرولۇق مۇرەككەپ ماددىنىڭ تەخمىنەن %10 ىدە بارلىقىنى مۆلچەرلىدۇق (16); بۇ يەردە، تۆۋەن يورۇقلۇق، ئوتتۇرا يورۇقلۇق ۋە يۇقىرى يورۇقلۇقتىكى ئۆسۈش ھۈجەيرىلىرىنىڭ ئىگىلىنىش نىسبىتى ئايرىم-ئايرىم ھالدا %15±0.6، %11±1 ۋە %0.9±0.5 (2F-رەسىم). ماسسا سپېكترومېتىرىيەسىنىڭ مىقدار جەھەتتىن سېلىشتۇرۇلۇشى شۇنى كۆرسەتتىكى، گىستىدىن بەلگىسىنى قوشۇش ياۋا تىپتىكى تۈرلەرگە سېلىشتۇرغاندا ئاقسىل-W نىڭ نىسپىي موللۇقىنى ئازايتمىدى (P = 0.59)، شۇڭا بۇ سەۋىيەلەر ئۆزگەرتىلگەن ئاقسىل-W نىڭ ئارتېفاكتى ئەمەس (S10-رەسىم). قانداقلا بولمىسۇن، RC-LH1 مۇرەككەپ ماددىسىدىكى ئاقسىل-W نىڭ بۇ تۆۋەن ئىگىلىنىش نىسبىتى بەزى RC لارنىڭ تېز سۈرئەتتە ئۆزگىرىشىگە يول قويۇپ، RC-LH116 مۇرەككەپ ماددىسىدىكى كىنون/خىنولون ئالمىشىشىنىڭ ئاستىلىشىنى پەسەيتىشى مۇمكىن. بىز يۇقىرى يورۇقلۇقتىكى ئىگىلىنىش نىسبىتىنىڭ يېقىنقى ترانسكرىپتومىكا سانلىق مەلۇماتلىرى بىلەن ماس كەلمەيدىغانلىقىنى بايقىدۇق، بۇ كۈچلۈك يورۇقلۇق ئاستىدا pufW گېنىنىڭ ئىپادىلىنىشىنىڭ ئاشىدىغانلىقىنى كۆرسىتىدۇ (S11-رەسىم) (23). pufW ترانسكرىپسىيەسى بىلەن ئاقسىل-W نىڭ RC-LH1 بىرىكمىسىگە قوشۇلۇشى ئوتتۇرىسىدىكى پەرقنى چۈشىنىش قىيىن بولۇپ، ئاقسىلنىڭ مۇرەككەپ تەڭشىلىشىنى ئەكىس ئەتتۈرۈشى مۇمكىن.
RC-LH114-W دا، 6 كاردىئولىپىن (CDL)، 7 فوسفاتىدىلخولىن (POPC)، 1 فوسفاتىدىلگلىتسېرىن (POPG) ۋە 29 β-DDM مولېكۇلاسى تەقسىملەنگەن ۋە مودېللاشتۇرۇلغان بولۇپ، 6 CDL، 24 POPC، 2 POPG ۋە 12 βDDM بار. RC-LH116 (5-رەسىم، A ۋە B). بۇ ئىككى قۇرۇلمىدا، CDL دېگۈدەك مۇرەككەپ ماددىنىڭ سىتوپلازما تەرىپىدە، POPC، POPG ۋە β-DDM بولسا كۆپىنچە لۇمىنال تەرىپىدە. RC-LH114-W مۇرەككەپ ماددىسىنىڭ αβ-1 دىن αβ-6 گىچە بولغان رايونىدا ئىككى ماي ۋە يۇيۇش سۇيۇقلۇقى مولېكۇلاسى ئايرىۋېتىلگەن (5A-رەسىم)، RC-LH116 نىڭ تەڭداش رايونىدا بەش مولېكۇلا ئايرىۋېتىلگەن (5B-رەسىم). بۇ مۇرەككەپ ماددىنىڭ يەنە بىر تەرىپىدە، ئاساسلىقى CDL دا، RC بىلەن αβ-7 دىن αβ-13 گىچە توپلانغان مايلار بايقالدى (5-رەسىم، A ۋە B). باشقا قۇرۇلمىلىق ئېرىگەن مايلار ۋە يۇيۇش سۇيۇقلۇقلىرى LH1 ھالقىسىنىڭ سىرتىدا، ياخشى ئېرىگەن ئاتسىل زەنجىرلىرى LH1 تارماق بىرلىكلىرى ئارىسىدا سوزۇلىدۇ، RC-LH114-W دا β-DDM دەپ بەلگىلەنگەن ۋە β-DDM ۋە POPC-LH116 نىڭ RC A ئارىلاشمىسىدا β-DDM دەپ ئېنىقلانغان. بىزنىڭ قۇرۇلمىمىزدىكى خېلات مايلىرى ۋە يۇيۇش سۇيۇقلۇقلىرىنىڭ ئوخشاش ئورنى ئۇلارنىڭ فىزىئولوگىيىلىك جەھەتتىن مۇناسىۋەتلىك باغلىنىش ئورنى ئىكەنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ (S12A-رەسىم). Tch دىكى ئوخشاش مولېكۇلالارنىڭ ئورنىمۇ ياخشى ماسلىشىشچانلىققا ئىگە. يۇمشاق ۋە Trv. 970 RC-LH1s تىپى (S12-رەسىم، B دىن E گىچە) (9، 12) ۋە لىپىد باشلىقى گۇرۇپپىسىنىڭ ھىدروگېن باغلىنىش قالدۇقلىرى تەرتىپ تەڭشىلىشىدە ياخشى ساقلانغانلىقىنى كۆرسەتتى (S13-رەسىم)، بۇ RC غا باغلىنىدىغان CDL ساقلانغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ (24)، بۇ ئورۇنلار RC-LH1 بىرىكمىسىدە ساقلانغان بولۇشى مۇمكىن.
(A ۋە B) RC-LH114-W (A) ۋە RC-LH116 (B) پېپتىدلىرى كارتون شەكىلدە، پىگمېنتلار بولسا تاياقچە شەكىلدە كۆرسىتىلگەن بولۇپ، 1-رەسىمدىكى رەڭ لايىھەسى قوللىنىلغان. مايلار قىزىل رەڭدە، يۇيۇش سۇيۇقلۇقى كۈلرەڭ رەڭدە كۆرسىتىلگەن. RC QA ۋە QB ئورۇنلىرىغا باغلانغان UQ سېرىق رەڭدە، ئايرىم UQ كۆك رەڭدە. (C ۋە D) مايلار قالدۇرۇلغان (A) ۋە (B) بىلەن ئوخشاش كۆرۈنۈشلەر. (E دىن G غىچە) RC-LH116 دىن ئېلىنغان Q1(E)، Q2(F) ۋە Q3(G) نىڭ چوڭايتىلغان كۆرۈنۈشى، بىر-بىرىگە تەسىر كۆرسىتىدىغان يان زەنجىرلەر. ھىدروگېن باغلىنىشى قارا رەڭلىك ئۈزۈك سىزىقلار شەكلىدە كۆرسىتىلگەن.
RC-LH116 دا، زەرەت ئايرىش جەريانىدا ئېلېكترون يۆتكىلىشىگە قاتنىشىدىغان RC QA ۋە QB UQ نىڭ ھەر ئىككىسى باغلىنىش ئورۇنلىرىدا پارچىلىنىدۇ. قانداقلا بولمىسۇن، RC-LH114-W دا، QB خىنون يېشىلمىدى، تۆۋەندە تەپسىلىي مۇھاكىمە قىلىنىدۇ. QA ۋە QB خىنونلىرىدىن باشقا، ئىككى خىلىتلانغان UQ مولېكۇلاسى (RC ۋە LH1 ھالقىسى ئارىسىدا) RC-LH114-W قۇرۇلمىسىدا ئۇلارنىڭ ياخشى يېشىلگەن باش گۇرۇپپىسىغا ئاساسەن (ئايرىم-ئايرىم ھالدا Q1 ۋە Q2 دا) تەقسىملىنىدۇ. بوشلۇق). 5C-رەسىم). Q1 غا ئىككى ئىزوپرېن بىرلىكى تەقسىم قىلىنغان، زىچلىق خەرىتىسى Q2 نىڭ تولۇق 10 ئىزوپرېن قۇيرۇقىنى ئېنىقلايدۇ. RC-LH116 نىڭ قۇرۇلمىسىدا، ئۈچ خىلىتلانغان UQ10 مولېكۇلاسى (Q1 دىن Q3 گىچە، 5D-رەسىم) يېشىلگەن، ھەمدە بارلىق مولېكۇلا قۇيرۇقنىڭ ھەممە يېرىدە ئېنىق زىچلىققا ئىگە (5-رەسىم، D دىن G گىچە). ئىككى قۇرۇلمىدا، Q1 ۋە Q2 نىڭ خىنون باش گۇرۇپپىلىرىنىڭ ئورنى ناھايىتى ياخشى ماسلىشىشچانلىققا ئىگە (S12F-رەسىم)، ئۇلار پەقەت RC بىلەن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىدۇ. Q1 RC-LH114-W نىڭ W بوشلۇقىنىڭ كىرىش ئېغىزىغا جايلاشقان (1G ۋە 5-رەسىم، C، D ۋە E)، Q2 بولسا QB باغلىنىش ئورنىغا يېقىن (5-رەسىم، C، D) ۋە F). ساقلانغان L-Trp143 ۋە L-Trp269 قالدۇقلىرى Q1 ۋە Q2 غا ناھايىتى يېقىن بولۇپ، π-قاتلاش ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىشى مۇمكىن (5-رەسىم، E ۋە F، ھەمدە S12-رەسىم). Q1 نىڭ يىراق ئوكسىگېنىدىن 3.0 Å ئايرىلغان L-Gln88 كۈچلۈك ھىدروگېن باغلىنىشى بىلەن تەمىنلەيدۇ (5E-رەسىم); بۇ قالدۇق ئەڭ يىراق مۇناسىۋەتتىن باشقا بارلىق RC لاردا ساقلانغان (S13-رەسىم). L-Ser91 باشقا كۆپىنچە RC لاردا Thr نىڭ ئورنىنى ئالىدۇ (S13-رەسىم)، Q1 نىڭ مېتىل ئوكسىگېنىدىن 3.8 ئانگستروم كېلىدۇ ۋە ئاجىز ھىدروگېن باغلىنىشى بىلەن تەمىنلەيدۇ (5E-رەسىم). Q3 نىڭ ئالاھىدە ئۆزئارا تەسىرى يوققا ئوخشايدۇ، ئەمما RC-M تارماق بىرلىكى بىلەن LH1-α نىڭ 5 دىن 6 گىچە بولغان تارماق بىرلىكى ئوتتۇرىسىدىكى گىدروفوب رايونغا جايلاشقان (5-رەسىم، D ۋە G). Q1، Q2 ۋە Q3 ياكى يېقىن ئەتراپتىكى خېلاتلانغان خىنونلار Tch. Gentle، Trv. Strain 970 ۋە Blc دا ئېرىپ كەتكەن. كۆز قارىچۇقىنىڭ قۇرۇلمىسى (9، 10، 12) RC-LH1 مۇرەككەپ بىرىكمىسىدىكى ساقلانغان ياردەمچى خىنون باغلىنىش ئورنىغا ئىشارەت قىلىدۇ (S12G-رەسىم). RC-LH116 دىكى بەش پارچىلانغان UQ يۇقىرى ئۈنۈملۈك سۇيۇقلۇق خروماتوگرافىيەسى (HPLC) ئارقىلىق بېكىتىلگەن ھەر بىر مۇرەككەپ ماددىنىڭ 5.8±0.7 قىممىتى بىلەن ياخشى ماس كېلىدۇ، RC-LH114-W دىكى ئۈچ پارچىلانغان UQ بولسا 6.2±0.3 دىن تۆۋەن. ئۆلچەنگەن قىممەت (S14-رەسىم) قۇرۇلمىدا ھەل قىلىنمىغان UQ مولېكۇلاسى بارلىقىنى كۆرسىتىدۇ.
ساختا سىممېترىك L ۋە M پولىپېپتىدلىرىنىڭ ھەر بىرى بەش TMH نى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ ۋە بىر BChl دىمېر، ئىككى BChl مونومېر، ئىككى باكتېرىيوفاگ (BPh) مونومېر ۋە بىر Heme بولمىغان تۆمۈر ۋە بىر ياكى ئىككى UQ10 مولېكۇلاسىنى بىرلەشتۈرگەن ھېتېرودىمېرنى ھاسىل قىلىدۇ. ئاخىرقى كېتون گۇرۇپپىسىدا ھىدروگېن باغلىنىشىنىڭ مەۋجۇتلۇقى ۋە ئۇنىڭ Rps دا توپلىنىشى ئارقىلىق، كاروتېنوئىدلار M-كىچىك بىرلىكىگە كىرگۈزۈلىدۇ، بۇ Cis-3,4-dehydroorhodopin دەپ ئاتىلىدۇ. تۈرلەر (25). RC-H نىڭ سىرتقى پەردە دائىرىسى پەردىگە بىرلا TMH ئارقىلىق باغلىنىدۇ. ئومۇمىي RC قۇرۇلمىسى مۇناسىۋەتلىك تۈرلەرنىڭ (مەسىلەن، Rba) ئۈچ كىچىك بىرلىكى RC غا ئوخشايدۇ. sphaeroides (PDB ID: 3I4D). BChl ۋە BPh نىڭ ماكروسىكلىكلىرى، كاروتېنوئىد ئومۇرتقا ماددىسى ۋە گېم بولمىغان تۆمۈر بۇ قۇرۇلمىلارنىڭ ئېنىقلىق دائىرىسى ئىچىدە قاپلىنىدۇ، QA ئورنىدىكى UQ10 باش گۇرۇپپىسى ۋە RC-LH116 دىكى QB خىنونمۇ شۇنداق (S15-رەسىم).
QB ئورنىنىڭ ئىگىلىنىش نىسبىتى ئوخشىمايدىغان ئىككى RC قۇرۇلمىسىنىڭ بولۇشى، QB خىنون باغلىنىشىغا ئەگىشىپ كېلىدىغان مۇقىم كونفورماسىيە ئۆزگىرىشلىرىنى تەكشۈرۈش ئۈچۈن يېڭى پۇرسەت يارىتىپ بېرىدۇ. RC-LH116 بىرىكمىسىدە، QB خىنون تولۇق باغلانغان «يېقىنقى» ئورۇندا (26) تۇرىدۇ، ئەمما RC-LH114-W نىڭ ئايرىلىشىدا QB خىنون يوق. RC-LH114-W دا QB خىنون يوق، بۇ ھەيران قالارلىق، چۈنكى بۇ بىرىكمە قۇرۇلمىلىق جەھەتتىن ئېرىتىلگەن QB خىنونغا ئىگە RC-LH116 بىرىكمىسىگە قارىغاندا ئاكتىپ. ئىككى LH1 ھالقىسى تەخمىنەن ئالتە خىنون خېلاتلىسىمۇ، بەشى يېپىق RC-LH116 ھالقىسىدا قۇرۇلمىلىق جەھەتتىن ئېرىيدۇ، پەقەت ئۈچىلا ئوچۇق RC-LH114-W ھالقىسىدا قۇرۇلمىلىق جەھەتتىن چەكلىك. بۇ قۇرۇلمىلىق قالايمىقانچىلىقنىڭ كۈچىيىشى RC-LH114-W QB ئورۇنلىرىنىڭ تېز ئالماشتۇرۇلۇشى، مۇرەككەپ ماددىدىكى خىنون كىنېتىكىسىنىڭ تېزلىشىشى ۋە LH1 ھالقىسىدىن ئۆتۈش ئېھتىماللىقىنىڭ ئېشىشىنى ئەكىس ئەتتۈرۈشى مۇمكىن. بىز RC-LH114-W نىڭ RC QB ئورنىدا UQ نىڭ كەمچىل بولۇشىنىڭ تېخىمۇ مۇرەككەپ ۋە تېخىمۇ ئاكتىپ مۇرەككەپ ماددىنىڭ نەتىجىسى بولۇشى مۇمكىنلىكىنى، ھەمدە RC-LH114-W نىڭ QB ئورنىنىڭ UQ ئايلىنىشىدا دەرھال توڭلىتىلغانلىقىنى پەرەز قىلىمىز. كونكرېت باسقۇچ (QB ئورنىنىڭ كىرىش ئېغىزى تاقالدى) بۇ پائالىيەتنىڭ شەكلىنى ئەكىس ئەتتۈرىدۇ.
QB بولمىسا، L-Phe217 نىڭ UQ10 باغلىنىشىغا ماس كەلمەيدىغان ئورۇنغا ئايلىنىشى، چۈنكى ئۇ قۇيرۇقنىڭ بىرىنچى ئىزوپرېن بىرلىكى بىلەن بوشلۇقتا سوقۇلۇش پەيدا قىلىدۇ (6A-رەسىم). بۇنىڭدىن باشقا، روشەن ئاساسلىق كونفوراتسىيە ئۆزگىرىشلىرى، بولۇپمۇ L-Phe217 نىڭ QB باغلىنىش خالتىسىغا يۆتكىلىدىغان spiral de (TMH D ۋە E ئارىسىدىكى قىسقا spiral) ۋە L-Tyr223 نىڭ ئايلىنىشى (6A-رەسىم) M-Asp45 رامكىسى بىلەن ھىدروگېن باغلىنىشىنى ئۈزۈش ۋە QB باغلىنىش ئورنىنىڭ كىرىش ئېغىزىنى تاقاش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدۇ (6B-رەسىم). spiral de ئاساسىغا ئايلىنىدۇ، L-Ser209 نىڭ Cα 0.33Å يۆتكىلىدۇ، L-Val221Cα بولسا 3.52Å يۆتكىلىدۇ. TMH D ۋە E دا كۆزىتىدىغان ئۆزگىرىش يوق، بۇ ئۆزگىرىشلەر ھەر ئىككى قۇرۇلمىدا ئۈستۈنكى ئورۇندا تۇرىدۇ (6A-رەسىم). بىزنىڭ بىلىشىمىزچە، بۇ تەبىئىي RC دىكى QB ئورنىنى تاقىغان تۇنجى قۇرۇلما. تولۇق (QB بىلەن باغلانغان) قۇرۇلما بىلەن سېلىشتۇرۇش شۇنى كۆرسىتىدۇكى، خىنوننىڭ رېدۇكسىيەلىنىشىدىن بۇرۇن، ئۇنىڭ خىنونغا كىرىشى ئۈچۈن بىر خىل ماسلىشىش ئۆزگىرىشى تەلەپ قىلىنىدۇ. L-Phe217 خىنون باش گۇرۇپپىسى بىلەن π-قاتلىنىش ئۆز-ئارا تەسىرىنى ھاسىل قىلىش ئۈچۈن ئايلىنىدۇ، ھەمدە سىپرال سىرتقا يۆتكىلىدۇ، بۇنىڭ بىلەن L-Gly222 نىڭ ئىسكىلىتى ۋە L-Tyr223 نىڭ يان زەنجىرى مۇقىم ھىدروگېن باغلىنىش قۇرۇلمىسىغا ئىگە ھىدروگېن باغلىنىش تورىنى ھاسىل قىلىدۇ (6-رەسىم، A ۋە C).
(A) گولوگرامما (L زەنجىرى، قىزغۇچ سېرىق/M زەنجىرى، قىزىل رەڭلىك) ۋە apo (كۈلرەڭ) قۇرۇلمىسىنىڭ ئۈستى-ئۈستىگە چاپلاشقان كارتون رەسىمى، بۇ قۇرۇلمىدا ئاچقۇچلۇق قالدۇقلار تاياقچە شەكىلدە كۆرسىتىلىدۇ. UQ10 سېرىق رەڭلىك بالداق بىلەن كۆرسىتىلىدۇ. نۇقتىلىق سىزىق پۈتۈن قۇرۇلمىدا شەكىللەنگەن ھىدروگېن باغلىنىشىنى كۆرسىتىدۇ. (B ۋە C) ئاپولىپوپروتېئىن ۋە پۈتۈن ھالقىسىمان قۇرۇلمىنىڭ يۈزەكى كۆرۈنۈشى، ئايرىم-ئايرىم ھالدا كۆك رەڭدە L-Phe217 ۋە قىزىل رەڭدە L-Tyr223 نىڭ يان زەنجىرسىمان ئوكسىگېنىنى گەۋدىلەندۈرىدۇ. L تارماق بىرلىكى قىزغۇچ سېرىق رەڭدە؛ M ۋە H تارماق بىرلىكلىرى رەڭلەنمىگەن. (D ۋە E) ئاپولىپوپروتېئىن (D) ۋە پۈتۈن (E) RC QB ئورۇنلىرى [ئايرىم-ئايرىم ھالدا (A) بويىچە رەڭلىنىدۇ] ۋە Thermophilus thermophilus PSII (يېشىل، كۆك ۋە پلاستىك خىنون بىلەن؛ PDB ID: 3WU2) تۈزلەڭ (58).
كۈتۈلمىگەندە، LH1 بولمىغان QB كەمچىل RC لارنىڭ بىر قانچە قۇرۇلمىسى مەۋجۇت بولسىمۇ، بۇ تەتقىقاتتا كۆزىتىلگەن كونفورماسىيە ئۆزگىرىشلىرى ئىلگىرى دوكلات قىلىنمىغان. بۇلار Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27)، Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) ۋە Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29) دىن كەلگەن QB نىڭ ئازىيىش قۇرۇلمىسىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ، بۇلارنىڭ ھەممىسى ئۇلارنىڭ ئومۇمىي QB قۇرۇلمىسى بىلەن دېگۈدەك ئوخشاش. 3PRC نى ئەستايىدىل تەكشۈرۈش ئارقىلىق، LDAO (لاۋرىل دىمېتىل ئامىن ئوكسىد) يۇيۇش سۇيۇقلۇقى مولېكۇلاسىنىڭ QB ئورنىنىڭ كىرىش ئېغىزىدا باغلىنىدىغانلىقى، بۇنىڭ يېپىق كونفورماسىيەگە قايتا تەشكىللىنىشىنىڭ ئالدىنى ئالىدىغانلىقى بايقالدى. LDAO 1EYS ياكى 1OGV دا ئوخشاش ئورۇندا پارچىلانمىسىمۇ، بۇ RC لار ئوخشاش يۇيۇش سۇيۇقلۇقى ئارقىلىق تەييارلىنىدۇ، شۇڭا ئوخشاش ئۈنۈمنى پەيدا قىلىشى مۇمكىن. Rba نىڭ كرىستال قۇرۇلمىسى. سىتوخروم c2 (PDB ID: 1L9B) بىلەن بىرلىكتە كىرىستاللاشقان Sphaeroides RC نىڭمۇ يېپىق QB ئورنى باردەك قىلىدۇ. قانداقلا بولمىسۇن، بۇ ئەھۋالدا، RC-M پولىپېپتىدنىڭ N-تېرمىنال رايونى (Q سىپرالىدىكى Tyr قالدۇقىنىڭ H باغلىنىشى ئارقىلىق QB باغلىنىش ئورنى بىلەن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىدۇ) تەبىئىي بولمىغان شەكىللىنىشنى قوبۇل قىلىدۇ، ھەمدە QB شەكىللىنىش ئۆزگىرىشى تېخىمۇ تەتقىق قىلىنمايدۇ (30). خاتىرجەملىك يېرى شۇكى، بىز RC-LH114-W قۇرۇلمىسىدا M پولىپېپتىدنىڭ بۇ خىل شەكىل ئۆزگىرىشىنى كۆرمىدۇق، بۇ RC-LH116 RC نىڭ N-تېرمىنال رايونى بىلەن دېگۈدەك ئوخشاش. شۇنىڭغا دىققەت قىلىش كېرەككى، يۇيۇش سۇيۇقلۇقى ئاساسلىق LH1 ئانتېنناسى يوقىتىلغاندىن كېيىن، PDB دىكى ئاپولىپوپروتېئىن RC لار يوقىتىلدى، بۇ RC بىلەن ئەتراپتىكى LH1 ھالقىسىنىڭ ئىچكى يۈزى ئارىسىدىكى بوشلۇقتىكى ئىچكى خىنون كۆلچەكلىرى ۋە لىپىدلارنى يوق قىلدى (31، 32). RC نىڭ ئىقتىدارى ياخشى، چۈنكى ئۇ پارچىلىنىدىغان QB خىنوندىن باشقا بارلىق كوفاكتورلارنى ساقلاپ قالىدۇ، چۈنكى ئۇ ئازراق مۇقىم بولۇپ، تەييارلاش جەريانىدا كۆپىنچە يوقاپ كېتىدۇ (33). بۇنىڭدىن باشقا، RC دىن LH1 ۋە تەبىئىي دەۋرىيلىك مايلارنى چىقىرىۋېتىشنىڭ ئىقتىدارلارغا تەسىر كۆرسىتىشى مۇمكىنلىكى مەلۇم، مەسىلەن، زەرەت بىلەن ئايرىلغان P+QB ھالىتىنىڭ ئۆمرىنىڭ قىسقىرىشى (31، 34، 35). شۇڭا، بىز RC نى ئوراپ تۇرغان يەرلىك LH1 ھالقىسىنىڭ مەۋجۇتلۇقى «تاقىلغان» QB ئورنىنى ساقلاپ قېلىشى، شۇ ئارقىلىق QB غا يېقىن يەرلىك مۇھىتنى ساقلاپ قېلىشى مۇمكىن دەپ پەرەز قىلىمىز.
گەرچە ئاپولىپروپ ...
بەزى فوتوتروفىك باكتېرىيە ۋە سىئانوباكتېرىيە، يۈسۈن ۋە ئۆسۈملۈكلەرنىڭ PSII بىرىكمىسىدە بايقالغان II تىپلىق RC قۇرۇلما ۋە فۇنكسىيەنى ساقلاش ئىقتىدارىغا ئىگە (38). 6-رەسىمدە كۆرسىتىلگەن قۇرۇلما ماسلىشىشچانلىقى (D ۋە E) PSII RC بىلەن باكتېرىيە RC بىرىكمىسىنىڭ QB ئورنى ئوتتۇرىسىدىكى ئوخشاشلىقنى تەكىتلەيدۇ. بۇ سېلىشتۇرۇش ئۇزۇندىن بۇيان خىنون باغلىنىش ۋە قايتۇرۇش سىستېمىسىنىڭ زىچ مۇناسىۋەتلىك سىستېمىسىنى تەتقىق قىلىش ئۈچۈن بىر مودېل بولۇپ كەلگەن. ئىلگىرىكى نەشر بۇيۇملىرىدا كونفورماسىيە ئۆزگىرىشلىرىنىڭ خىنونلارنىڭ PSII قايتۇرۇشى بىلەن بىللە بولىدىغانلىقى ئوتتۇرىغا قويۇلغان (39، 40). شۇڭا، RC نىڭ تەرەققىيات جەھەتتىن ساقلىنىشىنى كۆزدە تۇتقاندا، ئىلگىرى كۆزىتىلمىگەن بۇ باغلىنىش مېخانىزمى ئوكسىگېنلىق فوتوتروفىك ئۆسۈملۈكلەردىكى PSII RC نىڭ QB ئورنىغىمۇ قوللىنىلىشى مۇمكىن.
Rps ΔpufW (بەلگىسىز pufW ئۆچۈرۈش) ۋە PufW-His (تەبىئىي pufW ئورنىدىن ئىپادىلەنگەن C تېرمىنالى 10x His بەلگە قويۇلغان ئاقسىل-W) تۈرلىرى. palustris CGA009 ئالدىنقى ئەسەردە (16) تەسۋىرلەنگەن. بۇ تۈرلەر ۋە ئىزوگېنلىق ياۋا تىپلىق ئاتا-ئانا PYE (ھەر بىرى 5 گرام لىتىر -1) (LB دا -80 سېلسىيە گرادۇستا ساقلانغان، 50% (w/v) گلىتسېرىن) ئاقسىلى، ئېچىتقۇ ئېكىستراكتى ۋە سۇكسىنات) ئاگار [1.5% (w/v)] تەخسىسىگە ئاز ساندىكى ھۈجەيرىلەرنى سىلاش ئارقىلىق توڭلاتقۇدىن چىقىرىۋېلىندى. تەخسە ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا قاراڭغۇ جايدا، ئانائېروب شارائىتىدا بىر كېچە تۇرغۇزۇلدى، ئاندىن OSRAM 116-W گالوگېن لامپۇچكىسى (RS Components, UK) تەمىنلىگەن ئاق نۇر (~50 μmolm-2 s-1) بىلەن 3 كۈندىن 5 كۈنگىچە يورۇتۇلدى، ئاندىن بىر كولونىيە پەيدا بولغۇچە. بىرلا كولونىيە %0.1 (w/v) كازامىنو كىسلاتاسى (بۇنىڭدىن كېيىن M22 دەپ ئاتىلىدۇ) قوشۇلغان 10 مىللىلىتىر M22+ ئوتتۇرا (41) نى ئوكۇل قىلىش ئۈچۈن ئىشلىتىلدى. مەدەنىيەت تۆۋەن ئوكسىگېن شارائىتىدا، قاراڭغۇدا، 34 سېلسىيە گرادۇستا، 180 ئايلىنىش سۈرئىتىدە 48 سائەت چايقىلىپ ئۆستۈرۈلدى، ئاندىن 70 مىللىلىتىر مەدەنىيەت ئوخشاش شارائىتتا 24 سائەت ئوكۇل قىلىندى. 1 مىللىلىتىر ھەجىمدىكى يېرىم ئائېروب مەدەنىيەت ئارقىلىق 30 مىللىلىتىرلىق ئۇنىۋېرسال بۇرمىلىق سۈزۈك ئەينەك بوتۇلكىغا 30 مىللىلىتىر M22 ئوتتۇرا (ئوتتۇراھال) ئوكۇل قىلىنىپ، ستېرىل ماگنىت كۈچى ئارىلاشتۇرۇش تاياقچىسى ئارقىلىق 48 سائەت ئارىلاشتۇرۇلدى (~50μmolm-2 s-1). ئاندىن 30 مىللىلىتىر مەدەنىيەت ئوخشاش شارائىتتا تەخمىنەن 1 لىتىر مەدەنىيەت ئوكۇل قىلىندى، ئاندىن بۇ تەخمىنەن 9 لىتىر مەدەنىيەتكە 72 سائەت ~200 μmolm-2 s-1 نۇرى ئاستىدا ئوكۇل قىلىندى. ھۈجەيرىلەر 7132 RCF دا 30 مىنۇت مەركەزدىن قاچۇرۇش ئارقىلىق يىغىۋېلىندى، ئاندىن 20 mM tris-HCl نىڭ تەخمىنەن 10 مىللىلىتىر (pH 8.0) دا قايتا ئېرىتىلدى ۋە لازىم بولغۇچە -20 سېلسىيە گرادۇستا ساقلاندى.
ئېرىگەندىن كېيىن، قايتا ئېرىتىلگەن ھۈجەيرىلەرگە بىر قىسىم دېئوكسىرىبونۇكلېئازا I (Merck, ئەنگىلىيە)، لىزوزىم (Merck, ئەنگىلىيە) ۋە ئىككى دانە Roche گولوئېنزىم پروتېئازا چەكلىگۈچىسى تابلېتكىسى (Merck, ئەنگىلىيە) قوشۇڭ. 20،000 psi فرانسىيە بېسىملىق ھۈجەيرىسىدە (Aminco, ئامېرىكا) ھۈجەيرىلەر 8 دىن 12 قېتىمغىچە پارچىلاندى. پارچىلانمىغان ھۈجەيرىلەر ۋە ئېرىمەيدىغان قالدۇقلارنى 18،500 RCF تېمپېراتۇرىدا 4 سېلسىيە گرادۇستا 15 مىنۇت مەركەزدىن قاچۇرۇش ئارقىلىق ئېلىۋەتكەندىن كېيىن، پەردە 113،000 RCF تېمپېراتۇرىدا 43،000 سېلسىيە گرادۇستا 2 سائەت مەركەزدىن قاچۇرۇش ئارقىلىق پىگمېنتلىق لىزاتتىن چۆكمە قىلىندى. ئېرىيدىغان پارچىنى تاشلاپ، رەڭلىك پەردىنى 100 دىن 200 مىللىلىتىرغىچە 20 mM ترىس-HCl (pH 8.0) غا قايتا ئېرىتىڭ ۋە كۆرۈنگەن توپلاملار قالمىغۇچە بىر خىل ھالەتكە كەلتۈرۈڭ. ئېسىپ قويۇلغان پەردە 20 مىللىمېتىرلىق ترىس-HCl (pH 8.0) (Anatrace، ئامېرىكا) دا 2% (w/v) β-DDM تەركىبىدە 4 سېلسىيە گرادۇستا قاراڭغۇ جايدا 1 سائەت ئىنكۇباتسىيە قىلىنىپ، يېنىك ئارىلاشتۇرۇلدى. ئاندىن 70 سېلسىيە گرادۇستا 150،000 RCF نى 4 سېلسىيە گرادۇستا 1 سائەت ئېرىتىپ، قالغان ئېرىمەيدىغان ماددىلارنى چىقىرىۋەتتى.
ΔpufW تىپىدىكى ئېرىتكۈچى پەردە ئۈچ ئىستون ھەجىمى (CV) باغلاش بۇفېرى [20 mM tris-HCl (pH 8.0) تەركىبىدە %0.03 (w / v) β-DDM] بار بولغان 50 مىللىلىتىرلىق DEAE Sepharose ئىئون ئالماشتۇرۇش ئىستونىغا قويۇلدى. ئىستوننى ئىككى CV باغلاش بۇفېرى بىلەن يۇيۇڭ، ئاندىن ئىستوننى 50 mM NaCl تەركىبىدىكى ئىككى باغلاش بۇفېرى بىلەن يۇيۇڭ. RC-LH116 بىرىكمىسى 1.75 CV دا 150 دىن 300 mM NaCl غىچە بولغان سىزىقلىق گرادىيېنت بىلەن (باغلاش بۇفېرىدا) ئېلىيۇتسىيە قىلىندى، قالغان باغلاش بىرىكمىسى 0.5 CV دا 300 mM NaCl تەركىبىدىكى باغلاش بۇفېرى بىلەن ئېلىيۇتسىيە قىلىندى. 250 دىن 1000 نانومېتىرغىچە بولغان يۇتۇش سپېكتىرىنى توپلاڭ، يۇتۇش نىسبىتى (A880/A280) 1 دىن يۇقىرى بولغان كەسىرنى 880 دىن 280 نانومېتىرغىچە بولغان ئارىلىقتا ساقلاڭ، باغلاش بۇفېرىدا ئىككى قېتىم سۇيۇلدۇرۇڭ ۋە DEAE ئىستونىدا تازىلاش جەريانىدا ئوخشاش ئۇسۇلنى يەنە بىر قېتىم ئىشلىتىڭ. A880/A280 نىسبىتى 1.7 دىن يۇقىرى ۋە A880/A805 نىسبىتى 3.0 دىن يۇقىرى بولغان كەسىرلەرنى سۇيۇلدۇرۇڭ، ئۈچىنچى قېتىملىق ئىئون ئالماشتۇرۇشنى ئېلىپ بېرىڭ ۋە A880/A280 نىسبىتى 2.2 دىن يۇقىرى ۋە A880/A805 نىسبىتى 5.0 دىن يۇقىرى بولغان كەسىرلەرنى ساقلاڭ. قىسمەن تازىلانغان مۇرەككەپ ماددا Amicon 100,000 مولېكۇلا ئېغىرلىقىدىكى كېسىش (MWCO) مەركەزدىن قاچۇرۇش فىلتىرىغا (Merck, UK) تەخمىنەن 2 مىللىلىتىرغىچە قويۇقلاشتۇرۇلۇپ، 200 mM NaCl بۇفېرى بار Superdex 200 16/600 چوڭلۇقتىكى چىقىرىۋېتىش ئىستونىغا (GE Healthcare, US) قاچىلىنىپ، ئاندىن 1.5 CV دا ئوخشاش بۇفېردا ئېلۇتسىيە قىلىندى. چوڭلۇقتىكى چىقىرىۋېتىش قىسمىنىڭ يۇتۇش سپېكتىرىنى توپلاڭ، يۇتۇش سپېكتىرىنى A880/A280 نىسبىتى 2.4 تىن يۇقىرى ۋە A880/A805 نىسبىتى 5.8 دىن 100 A880 گىچە بولغان ئارىلىقتا قويۇقلاشتۇرۇڭ ۋە دەرھال توڭلىتىش-TEM تورىنى تەييارلاش ياكى ساقلاش ئۈچۈن ئىشلىتىڭ. لازىم بولغۇچە -80°C دا ساقلاڭ.
PufW-His تۈرىدىكى ئېرىتكۈچى پەردە IMAC بۇففېرىدىكى 20 مىللىلىتىرلىق HisPrep FF Ni-NTA Sepharose ئىستونىغا (200 mM NaCl ۋە 0.03% (w/w)) قوشۇلغان 20 mM tris-HCl (pH 8.0)) سۈرۈلدى (GE Healthcare). v) β-DDM]. ئىستون بەش CV IMAC بۇففېرى بىلەن، ئاندىن 10 mM ھىستىدىن قوشۇلغان بەش CV IMAC بۇففېرى بىلەن يۇيۇلدى. يادرولۇق بىرىكمە ئىستوندىن 100 mM ھىستىدىن قوشۇلغان بەش IMAC بۇففېرى بىلەن چىقىرىۋېتىلدى. RC-LH114-W بىرىكمىسىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان بۆلەك Amicon 100,000 MWCO فىلتىرى (Merck, UK) بىلەن تەمىنلەنگەن ئارىلاشتۇرۇلغان باكتا ~10 مىللىلىتىرغىچە قويۇقلاشتۇرۇلۇپ، باغلاش بۇففېرى بىلەن 20 قېتىم سۇيۇلدۇرۇلۇپ، ئاندىن 25 مىللىلىتىرغا قوشۇلدى. DEAE Sepharose ئىستونىدا، ئالدىن بۇففېرغا باغلانغان تۆت CV ئىشلىتىلىدۇ. تۈۋرۈكنى تۆت CV باغلاش بۇففېرى بىلەن يۇيۇڭ، ئاندىن سەككىز CV دا 0 دىن 100 mM NaCl غىچە بولغان سىزىقلىق گرادىيېنتتا (باغلاش بۇففېرىدا) مۇرەككەپ ماددىنى ئېلىيۇتسىيە قىلىڭ، قالغان تۆت CV دا 100 mM باغلاش بۇففېرى بار. ناترىي خىلورىد ئۈستىدە ئېلىيۇتسىيە قىلىنغان قالدۇق مۇرەككەپ ماددىلىرى A880/A280 نىسبىتى 2.4 تىن يۇقىرى ۋە A880/A805 نىسبىتى 4.6 دىن يۇقىرى كەسىرلەر بىلەن بىرلەشتۈرۈلۈپ، Amicon 100,000 MWCO مەركەزدىن قاچۇرۇش سۈزگۈچتە ~2 ml غىچە قويۇقلاشتۇرۇلدى ۋە ئالدىن 1.5 CV IMAC بىلەن تولدۇرۇلدى. بۇففېر Superdex 200 16/600 چوڭلۇقتىكى چىقىرىۋېتىش تۈۋرۈكى بىلەن تەڭشەلدى، ئاندىن ئوخشاش بۇففېردا 1.5 CV ئۈستىدە ئېلىيۇتسىيە قىلىندى. چوڭ-كىچىكلىكنى چىقىرىۋېتىش كەسىرلىرىنىڭ يۇتۇش سپېكتىرىنى توپلاڭ ۋە يۇتۇش سپېكتىرىنى A880/A280 نىسبىتى 2.1 دىن يۇقىرى ۋە A880/A805 نىسبىتى 4.6 دىن 100 گىچە بولغان A880 گىچە مەركەزلەشتۈرۈڭ، بۇلار دەرھال توڭلىتىلغان TEM تور تەييارلاشقا ئىشلىتىلىدۇ ياكى لازىم بولغۇچە -80 سېلسىيە گرادۇستا ساقلىنىدۇ.
تۆۋەن تېمپېراتۇرىلىق TEM تورلىرىنى تەييارلاش ئۈچۈن Leica EM GP چىلاش مۇزلاتقۇچ ئىشلىتىلدى. بۇ مۇرەككەپ ماددا IMAC بۇففېرىدا A880 نىڭ 50 گىچە سۇيۇلدۇرۇلدى، ئاندىن 5μl يېڭى پارقىراقلىق بىلەن چىقىرىۋېتىلگەن QUANTIFOIL 1.2/1.3 كاربون قاپلانغان مىس تورغا (Agar Scientific, UK) قاچىلاندى. تورنى 20 سېلسىيە گرادۇسلۇق تېمپېراتۇرىدا ۋە نىسپىي نەملىكنىڭ %60 لىك دەرىجىسىدە 30 سېكۇنت ئىنكۇباتسىيە قىلىڭ، ئاندىن 3 سېكۇنت قۇرۇتۇڭ، ئاندىن -176 سېلسىيە گرادۇسلۇق سۇيۇق ئېتاندا سوۋۇتۇڭ.
RC-LH114-W بىرىكمىسىنىڭ سانلىق مەلۇماتلىرى 300kV تېزلىنىش توك بېسىمىدا ئىشلەيدىغان، 130،000× چوڭايتىش ۋە 20 eV ئېنېرگىيە بىلەن ئىشلەيدىغان Titan Krios مىكروسكوپى ئارقىلىق eBIC (ئېلېكترونلۇق بىئو سۈرەت مەركىزى) (ئەنگىلىيە ئالماس نۇر مەنبەسى) غا خاتىرىلەنگەن. K2 چوققىسى ئېنىقلىغۇچلۇق Gatan 968 GIF Quantum سانلىق مەلۇمات توپلاش ئۈچۈن ساناش ھالىتىدە سۈرەتلەرنى خاتىرىلەش ئۈچۈن ئىشلىتىلگەن. كالىبرلانغان پىكسېل چوڭلۇقى 1.048Å، دورا مىقدارى 3.83 e-Å-2s-1. فىلىم 11 سېكۇنتتا توپلىنىپ، 40 قىسىمغا بۆلۈنگەن. كاربون قاپلانغان رايون ئارقىلىق مىكروسكوپنى قايتا فوكۇسلاشتۇرۇڭ، ئاندىن ھەر بىر تۆشۈكتىن ئۈچ فىلىم توپلاڭ. جەمئىي 3130 فىلىم توپلانغان بولۇپ، فوكۇسسىزلاندۇرۇش قىممىتى -1 دىن -3μm غىچە بولغان.
RC-LH116 بىرىكمىسىنىڭ سانلىق مەلۇماتلىرى ئاستېربۇرى بىئو قۇرۇلما تەجرىبىخانىسىدا (لېدس ئۇنىۋېرسىتېتى، ئەنگىلىيە) ئوخشاش مىكروسكوپ ئارقىلىق توپلانغان. سانلىق مەلۇماتلار 130 k چوڭايتىش ئارقىلىق ساناش ھالىتىدە توپلانغان، پىكسېل چوڭلۇقى 4.6 e-Å-2s-1 نۇرى بىلەن 1.065 Å غا تەڭشەلگەن. فىلىم 12 سېكۇنت ئىچىدە خاتىرىلەنگەن ۋە 48 قىسىمغا بۆلۈنگەن. جەمئىي 3359 فىلىم توپلانغان بولۇپ، فوكۇسسىزلاشتۇرۇش قىممىتى -1 دىن -3μm غىچە بولغان.
بارلىق سانلىق مەلۇماتلارنى بىر تەرەپ قىلىش Relion 3.0 تۇرۇبا يولى (42) دا ئېلىپ بېرىلىدۇ. دوزا ئېغىرلىقى ئارقىلىق نۇر ھەرىكىتىنى تۈزىتىش ئۈچۈن Motioncorr 2 (43) نى ئىشلىتىڭ، ئاندىن CTFFIND 4.1 (44) نى ئىشلىتىپ CTF (كونتراستلىق ئۆتكۈزۈش فۇنكسىيەسى) پارامېتىرىنى بېكىتىڭ. بۇ دەسلەپكى بىر تەرەپ قىلىش باسقۇچلىرىدىن كېيىنكى تىپىك فوتومىكروگرافىيەلەر 2-رەسىمدە كۆرسىتىلدى. S16. ئاپتوماتىك تاللاش قېلىپى 250 پىكسېللىق رامكىدا ۋە ئىككى ئۆلچەملىك (2D) تۈرگە ئايرىشسىز 1000 دانە زەررىچىنىڭ تەخمىنەن 250 پىكسېلىنى قولدا تاللاش ئارقىلىق ھاسىل قىلىنىدۇ، بۇ ئارقىلىق ئەۋرىشكە بۇلغىنىشىغا ماس كېلىدىغان ياكى پەرقلەندۈرگىلى بولىدىغان ئالاھىدىلىككە ئىگە بولمىغان تۈرگە ئايرىشلار رەت قىلىنىدۇ. ئاندىن، بارلىق مىكروفوتوگرافىيەلەردە ئاپتوماتىك تاللاش ئېلىپ بېرىلدى، RC-LH114-W 849359 زەررىچە، RC-LH116 مۇرەككەپ ماددىسى 476547 زەررىچە بولدى. تاللانغان بارلىق زەررىچىلەر ئىككى قېتىملىق پايدىلىنىشسىز 2D تۈرگە ئايرىش سىنىقىدىن ئۆتتى، ھەر بىر قېتىملىق تەكشۈرۈشتىن كېيىن، كاربون رايونىغا ماس كېلىدىغان زەررىچىلەر، ئەۋرىشكە بۇلغىنىشى، روشەن ئالاھىدىلىكلىرى يوق ياكى كۈچلۈك قاپسىلىپ قالغان زەررىچىلەر رەت قىلىنىدۇ، نەتىجىدە RC-LH114-W ۋە RC-LH116 نىڭ 3D تۈرگە ئايرىش ئۈچۈن ئايرىم-ئايرىم ھالدا 772033 (90.9%) ۋە 359678 (75.5%) زەررىچىلەر ئىشلىتىلىدۇ. دەسلەپكى 3D پايدىلىنىش مودېلى ستوخاستىك گرادىيېنت چۈشۈش ئۇسۇلى ئارقىلىق ھاسىل قىلىندى. دەسلەپكى مودېلنى پايدىلىنىش ئۈچۈن، تاللانغان زەررىچىلەر 3D دا تۆت تۈرگە ئايرىلىدۇ. بۇ تۈردىكى مودېلنى پايدىلىنىش ئۈچۈن، ئەڭ چوڭ تۈردىكى زەررىچىلەردە 3D تازىلاش ئېلىپ بېرىڭ، ئاندىن دەسلەپكى 15Å تۆۋەن ئۆتكۈزۈشلۈك فىلتىرنى ئىشلىتىپ ئېرىتكۈچى رايونىنى يېپىڭ، يۇمشاق گىرۋەكلەردىن 6 پىكسېل قوشۇڭ ۋە ئۈستۈنكى دېتېكتورنىڭ Gatan K2 چوققىسى مودۇلياتسىيەسى ئۆتكۈزۈش ئىقتىدارىنى تۈزىتىش ئۈچۈن پىكسېللارنى قايتا بىر تەرەپ قىلىڭ. RC-LH114-W سانلىق مەلۇمات توپلىمى ئۈچۈن، بۇ دەسلەپكى مودېل ماسكىنىڭ گىرۋىكىدىكى كۈچلۈك زىچلىقنى چىقىرىۋېتىش ئارقىلىق ئۆزگەرتىلدى (UCSF Chimera دىكى يادرولۇق مۇرەككەپ زىچلىقتىن ئايرىلىدۇ). نەتىجىدە ھاسىل بولغان مودېللار (RC-LH114-W ۋە RC-LH116 نىڭ ئېنىقلىق دەرىجىسى ئايرىم-ئايرىم ھالدا 3.91 ۋە 4.16 Å) ئىككىنچى باسقۇچلۇق 3D تۈرگە ئايرىش ئۈچۈن پايدىلىنىش ماتېرىيالى سۈپىتىدە ئىشلىتىلىدۇ. ئىشلىتىلگەن زەررىچىلەر دەسلەپكى 3D سىنىپىغا گۇرۇپپىلىنىدۇ ۋە قوشنا بىلەن كۈچلۈك باغلىنىشنى ئۆز ئىچىگە ئالمايدۇ. روشەن قۇرۇلما ئالاھىدىلىكلىرى قاپلىنىدۇ ياكى يوق. ئىككىنچى باسقۇچلۇق 3D تۈرگە ئايرىشتىن كېيىن، ئەڭ يۇقىرى ئېنىقلىققا ئىگە تۈر تاللاندى [RC-LH114-W ئۈچۈن، بىر تۈر 377,703 زەررىچە (44.5%)، RC-LH116 ئۈچۈن، جەمئىي 260,752 زەررىچە (54.7%)، بۇ يەردە ئۇلار پەقەت دەسلەپكى ئايلىنىشتىن كېيىن كىچىك پەرق بىلەن ماسلاشتۇرۇلغاندا ئوخشاش بولىدۇ]. تاللانغان زەررىچىلەر 400 پىكسېللىق قۇتىغا قايتا ئېلىنىپ، 3D تازىلاش ئارقىلىق تازىلايدۇ. ئېرىتكۈچى ماسكىسى دەسلەپكى 15Å تۆۋەن ئۆتكۈزۈش فىلتىرى، 3 پىكسېللىق خەرىتە كېڭەيتىش ۋە 3 پىكسېللىق يۇمشاق ماسكا ئارقىلىق ھاسىل قىلىنىدۇ. ھەر بىر زەررىچە CTF تازىلاش، ھەر بىر زەررىچە ھەرىكىتىنى تۈزىتىش ۋە ھەر بىر زەررىچە CTF تازىلاشنىڭ ئىككىنچى باسقۇچى ئارقىلىق، ھەر بىر باسقۇچتىن كېيىن 3D تازىلاش، ئېرىتكۈچى ماسكىسى ۋە كېيىنكى بىر تەرەپ قىلىش ئېلىپ بېرىلىپ، نەتىجىدە ھاسىل بولغان تېكىستۇرىنى تېخىمۇ ياخشىلاشقا بولىدۇ. FSC (Fourier Shell كوررېلاتسىيە كوئېففىتسېنتى) نىڭ 0.143 چەك قىممىتىنى ئىشلىتىپ، RC-LH114-W ۋە RC-LH116 نىڭ ئاخىرقى مودېللىرىنىڭ ئېنىقلىقى ئايرىم-ئايرىم ھالدا 2.65 ۋە 2.80Å بولىدۇ. ئاخىرقى مودېلنىڭ FSC ئەگرى سىزىقى 2-رەسىمدە كۆرسىتىلدى. S17.
بارلىق ئاقسىل تەرتىپلىرى UniProtKB دىن چۈشۈرۈلدى: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) RC نىڭ گومولوگىيەلىك مودېلىنى قۇرۇش ئۈچۈن ئىشلىتىلدى، بۇ مودېل RC-L، RC-M ۋە RC-H نىڭ ئاقسىل تەرتىپلىرى ۋە Rba نىڭ كرىستال قۇرۇلمىسىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ. sphaeroides RC قېلىپ سۈپىتىدە ئىشلىتىلدى (PDB ID: 5LSE) (46). UCSF Chimera دىكى «خارىتە ماسلاشتۇرۇش» قورالىنى ئىشلىتىپ ھاسىل قىلىنغان مودېلنى خەرىتىگە ماسلاشتۇرۇڭ (47)، ئاقسىل قۇرۇلمىسىنى ياخشىلاڭ ۋە بىرلىكتە ئىشلەپچىقارغۇچى [4×BChlα (مونومېر كۈتۈپخانىسى قالدۇقىنىڭ نامى = BCL)، 2×BPhα (BPH)، بىر ياكى ئىككى خىل UQ10 (U10)، بىر خىل گېم بولمىغان تۆمۈر (Fe) ۋە بىر خىل 3،4-دىھىدروھېكساكاربونىلخولىن (QAK)] نى قوشۇپ، Coot (48) نى ئىشلىتىڭ. QAK مونومېر كۈتۈپخانىسىدا يوق بولغاچقا، PHENIX (49) دىكى eLBOW قورالى ئارقىلىق پارامېتىرلاشتۇرۇلدى.
ئاندىن، LH1 تارماق بىرلىكى قۇرۇلدى. دەسلەپتە، PHENIX (49) دىكى ئاپتوماتىك قۇرۇش قورالى خەرىتە ۋە LH1-α ۋە LH1-β ئاقسىل تەرتىپلىرىنى كىرگۈزۈش ئارقىلىق LH1 تەرتىپلىرىنىڭ بىر قىسمىنى ئاپتوماتىك قۇرۇش ئۈچۈن ئىشلىتىلدى. ئەڭ تولۇق LH1 تارماق بىرلىكىنى تاللاپ، ئۇنى چىقىرىپ، Coot غا قاچىلاڭ، قولدا يوقاپ كەتكەن تەرتىپنى قوشۇڭ ۋە ئىككى BCl a (BCL) ۋە بىر سپىرىللوكسانتىن (CRT) قوشۇشتىن بۇرۇن پۈتۈن قۇرۇلمىنى قولدا تۈزىتىڭ [مۇناسىۋەتلىك Rps غا ئاساسەن. LH1 مۇرەككەپ بىرىكمىسىنىڭ زىچلىقى ۋە مەلۇم كاروتىنوئىد تەركىبى. تۈرلەر (17)]. تولۇق LH1 تارماق بىرلىكىنى كۆچۈرۈڭ ۋە UCSF Chimera «ئۇلاش خەرىتىسى قورالى» نى ئىشلىتىپ، LH1 زىچلىقىنىڭ قوشنا مودېلسىز رايونىغا ئۇلاڭ، ئاندىن ئۇنى Coot دا تۈزىتىڭ؛ بارلىق LH1 تارماق بىرلىكلىرى مودېللاشتۇرۇلغۇچە بۇ جەرياننى تەكرارلاڭ. RC-LH114-W قۇرۇلمىسى ئۈچۈن، Coot دىكى تەقسىملەنمىگەن زىچلىقنى ئايرىش ئارقىلىق، ئاقسىل USCF Chimera خەرىتىسىدىكى قالغان ئاقسىل بولمىغان تەركىبلەردىن ئايرىلىدۇ ۋە Autobuild قورالى دەسلەپكى مودېلنى قۇرۇشقا ئىشلىتىلىدۇ، قالغان تارماق بۆلەكلەر (ئاقسىل-W) مودېللاشتۇرۇش. PHENIX (49) دا. Coot (48) دىكى نەتىجىدە پەيدا بولغان مودېلغا يوقاپ كەتكەن تەرتىپلەرنى قوشۇڭ، ئاندىن پۈتۈن تارماق بۆلەكنى قولدا ئېنىقلاڭ. قالغان تەقسىملەنمىگەن زىچلىق لىپىدلارنىڭ (CDL = CDL، POPC = 6PL ۋە POPG = PGT نىڭ PDB مونومېر كۈتۈپخانىسى نومۇرى)، β-DDM يۇيۇش سۇيۇقلۇقى (LMT) ۋە UQ10 مولېكۇلاسىنىڭ (U10) بىرىكمىسىگە ماس كېلىدۇ. مودېل ستاتىستىكىسى ۋە ماسلىشىشنىڭ كۆرۈنۈش سۈپىتىنى تېخىمۇ ياخشىلىغۇچە، تولۇق دەسلەپكى مودېلنى مۇكەممەللەشتۈرۈش ئۈچۈن Coot (48) دا PHENIX ئەلالاشتۇرۇش (49) ۋە قولدا ئەلالاشتۇرۇشنى ئىشلىتىڭ. ئاخىرىدا، يەرلىك خەرىتىنى ئېنىقلاشتۇرۇش ئۈچۈن LocScale (50) نى ئىشلىتىڭ، ئاندىن تەقسىملەنمىگەن زىچلىقنى مودېللاشتۇرۇشنىڭ باشقا بىر قانچە دەۋرىيلىكىنى، شۇنداقلا ئاپتوماتىك ۋە قولدا ئەلالاشتۇرۇشنى ئىجرا قىلىڭ.
ئايرىم-ئايرىم پېپتىدلار، كوفاكتورلار ۋە باشقا مايلار ۋە خىنونلارنىڭ زىچلىقى 1- ۋە 2- رەسىملەردە كۆرسىتىلدى. S18 دىن S23 گىچە. ئاخىرقى مودېلنىڭ ستاتىستىكىلىق ئۇچۇرلىرى S1 جەدۋەلدە كۆرسىتىلدى.
باشقىچە بەلگىلىمە بولمىغاندا، UV/Vis/NIR يۇتۇش سپېكترى Cary60 سپېكتروفوتومېتىرىدا (Agilent، ئامېرىكا) 250 nm دىن 1000 nm غىچە بولغان 1 nm ئارىلىقتا ۋە 0.1s بىرلەشتۈرۈش ۋاقتى بىلەن توپلاندى.
ئەۋرىشكىنى 2 مىللىمېتىرلىق يول بىلەن كۋارتس كۇۋېتىغا سېلىپ، A880 نىڭ 1 گە تەڭشەپ، 400 دىن 1000 نانومېتىرغىچە بولغان يۇتۇش سپېكتىرىنى توپلاڭ. يۇمىلاق ئىككىلىك سپېكتىرلار Jasco 810 سپېكتروپوليارىمېترىدا (Jasco، ياپونىيە) 400 نانومېتىردىن 950 نانومېتىرغىچە بولغان 1 نانومېتىر ئارىلىقتا 20 نانومېتىر مىنۇت-1 سىكانىرلاش سۈرئىتىدە توپلاندى.
مولار يوقىلىش كوئېففىتسېنتى يادرولۇق مۇرەككەپ ماددىنى تەخمىنەن 50 گە A880 گە سۇيۇلدۇرۇش ئارقىلىق بېكىتىلىدۇ. 10μl ھەجىمنى 990μl باغلىنىش بۇفېرى ياكى مېتانولدا سۇيۇلدۇرۇپ، BChl پارچىلىنىشىنى ئەڭ تۆۋەن چەككە چۈشۈرۈش ئۈچۈن دەرھال يۇتۇش سپېكتىرىنى توپلاڭ. ھەر بىر مېتانول ئەۋرىشكىسىنىڭ BChl مىقدارى 54.8 mM-1 cm-1 نىڭ 771 nm دىكى يوقىلىش كوئېففىتسېنتى ئارقىلىق ھېسابلىنىدۇ، ھەمدە يوقىلىش كوئېففىتسېنتى بېكىتىلىدۇ (51). ئۆلچەنگەن BChl قويۇقلۇقىنى 32 (RC-LH114-W) ياكى 36 (RC-LH116) غا بۆلۈپ، يادرولۇق مۇرەككەپ ماددىنىڭ قويۇقلۇقىنى بېكىتىڭ، ئاندىن بۇ بۇفېر يوقىلىش كوئېففىتسېنتىغا توپلانغان ئوخشاش ئەۋرىشكىنىڭ يۇتۇش سپېكتىرىنى بېكىتىشتە ئىشلىتىلىدۇ. پاراللېل. ھەر بىر ئەۋرىشكە ئۈچ قېتىم قايتا ئۆلچەش ئېلىپ بېرىلدى، ھەمدە BChl Qy ئەڭ يۇقىرى قىممىتىنىڭ ئوتتۇرىچە يۇتۇشچانلىقى ھېسابلاش ئۈچۈن ئىشلىتىلدى. 878 nm دا ئۆلچەنگەن RC-LH114-W نىڭ يوقىلىش كوئېففىتسېنتى 3280±140 mM-1 cm-1، 880 nm دا ئۆلچەنگەن RC-LH116 نىڭ يوقىلىش كوئېففىتسېنتى بولسا 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 (52) دىكى ئۇسۇلغا ئاساسەن مىقدارلاشتۇرۇلدى. قىسقىسى، Agilent 1200 HPLC سىستېمىسى ئارقىلىق تەتۈر باسقۇچلۇق HPLC (RP-HPLC) ئېلىپ بېرىلدى. تەخمىنەن 0.02 nmol RC-LH116 ياكى RC-LH114-W نى 50μl 0.02% (w/v) تۆمۈر خىلورىد تەركىبىدىكى 50:50 مېتانول:خلوروفورمغا ئېرىتىڭ ۋە ئالدىن تەڭشەلگەن Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm نى ئوكۇل قىلىڭ. 40°C تېمپېراتۇرىدا 1 ml-1 min-1 دا HPLC ئېرىتكۈچىدە (80:20 مېتانول:2-پروپانول) ×25 cm لىق ئىستونغا ئوكۇل قىلىڭ. 275 nm (UQ10)، 450 nm (كاروتىنوئىد) ۋە 780 nm (BChl) دا 1 سائەت سۈمۈرۈلۈشنى كۆزىتىش ئۈچۈن HPLC ئېرىتكۈچىدە ئىزوكراتىك ئېلىيۇتسىيە ئېلىپ بېرىڭ. 275 نانومېتىرلىق خروماتوگراممىدىكى 25.5 مىنۇتتىكى چوققا بىرلەشتۈرۈلگەن بولۇپ، ئۇنىڭدا باشقا بايقىغىلى بولىدىغان بىرىكمىلەر يوق ئىدى. بىرلەشتۈرۈلگەن رايون 0 دىن 5.8 نانومېتىرغىچە بولغان ساپ ئۆلچەملەرنى كىرگۈزۈشتىن ھېسابلىنىپ چىقىرىلغان كالىبراتسىيە ئەگرى سىزىقىغا ئاساسەن ئېلىنغان UQ10 نىڭ مول مىقدارىنى ھېسابلاشقا ئىشلىتىلىدۇ (S14-رەسىم). ھەر بىر ئەۋرىشكە ئۈچ قېتىم تەكرار تەھلىل قىلىندى، دوكلات قىلىنغان خاتالىق ئوتتۇرىچە قىممەتنىڭ SD غا ماس كېلىدۇ.
ئەڭ يۇقىرى Qy سۈمۈرۈش مىقدارى 0.1 بولغان RC-LH1 بىرىكمىسىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان ئېرىتمە 30 μM تۆۋەنلىتىلگەن ئات يۈرىكى سىتروخروم c2 (Merck, ئەنگىلىيە) ۋە 0 دىن 50 μMUQ2 (Merck, ئەنگىلىيە) ئارقىلىق تەييارلاندى. ھەر بىر UQ2 قويۇقلۇقىدا ئۈچ 1 مىللىلىتىرلىق ئەۋرىشكە تەييارلىنىپ، ئۆلچەشتىن بۇرۇن قاراڭغۇلۇققا تولۇق ماسلىشىش ئۈچۈن، قاراڭغۇدا 4 سېلسىيە گرادۇستا بىر كېچە قويۇپ قويۇلدى. ئېرىتمە 300 nm ئوت/500 سىزىقلىق تور، 1.24 مىللىمېتىرلىق كىرىش ئېغىزى، 0.12 مىللىمېتىرلىق ئوتتۇرا ۋە 0.6 مىللىمېتىرلىق چىقىش ئېغىزى بىلەن تەمىنلەنگەن OLIS RSM1000 مودۇللۇق سپېكتروفوتومېتىرغا قاچىلاندى. قوزغىتىش نۇرىنى چىقىرىۋېتىش ئۈچۈن، ئەۋرىشكە فوتو تۇرۇبىسى ۋە پايدىلىنىش فوتو كۆپەيتكۈچ تۇرۇبىسىنىڭ كىرىش ئېغىزىغا 600 nm ئۇزۇنلۇقتىكى ئۆتكۈزۈش فىلتىرى قويۇلدى. سۈمۈرۈش مىقدارى 550 nm دا 0.15 سېكۇنت بىرلەشتۈرۈش ۋاقتى بىلەن كۆزىتىلدى. قوزغىتىش نۇرى 880 nm M880F2 LED (يورۇقلۇق چىقىرىش دىئودى) (Thorlabs Ltd., UK) دىن DC2200 كونتروللىغۇچ (Thorlabs Ltd., UK) ئارقىلىق %90 كۈچلۈكلۈكتىكى تالا ئوپتىك كابېل ئارقىلىق تارقىتىلىدۇ ۋە 90° بۇلۇڭدا يورۇقلۇق مەنبەسىگە تارقىتىلىدۇ. ئۆلچەش نۇرى ئەينەككە قارشى تۇرۇپ، ئەۋرىشكە تەرىپىدىن دەسلەپتە سۈمۈرۈلمىگەن نۇرنى قايتۇرۇڭ. يورۇتۇش 50 سېكۇنتتىن بۇرۇن 10 سېكۇنت سۈمۈرۈلۈشنى كۆزىتىڭ. ئاندىن كۋىنولولنىڭ سىتوخروم c23+ نى ئۆزلۈكىدىن قانداق دەرىجىدە تۆۋەنلىتىش دەرىجىسىنى باھالاش ئۈچۈن قاراڭغۇدا 60 سېكۇنت سۈمۈرۈلۈشنى يەنە كۆزىتىڭ (خام سانلىق مەلۇماتلار ئۈچۈن S8-رەسىمگە قاراڭ).
سانلىق مەلۇماتلار 0.5 سېكۇنتتىن 10 سېكۇنتقىچە بولغان ۋاقىت ئىچىدە (UQ2 قويۇقلۇقىغا ئاساسەن) سىزىقلىق باشلانغۇچ سۈرئەتنى تەڭشەش ۋە ھەر بىر UQ2 قويۇقلۇقىدىكى ئۈچ ئەۋرىشكىنىڭ سۈرئىتىنى ئوتتۇرىچە ھېسابلاش ئارقىلىق بىر تەرەپ قىلىندى. ئايرىم-ئايرىم يوقىتىش كوئېففىتسېنتى بىلەن ھېسابلانغان RC-LH1 قويۇقلۇقى سۈرئەتنى كاتالىزاتورلۇق ئۈنۈمگە ئايلاندۇرۇش ئۈچۈن ئىشلىتىلدى، بۇ Origin Pro 2019 (OriginLab, ئامېرىكا) دا سىزىلغان ۋە Michaelis-Menten مودېلىغا ماسلاشتۇرۇلغان بولۇپ، كۆرۈنگەن Km ۋە Kcat قىممەتلىرىنى بېكىتتى.
ۋاقىتلىق يۇتۇش ئۆلچەشلىرى ئۈچۈن، RC-LH1 ئەۋرىشكىسى 50 mM ناترىي ئاسكوربات (Merck, ئامېرىكا) ۋە 0.4 mM تېربۇتىن (Merck, ئامېرىكا) بار IMAC بۇففېرىدا ~2μM غىچە سۇيۇلدۇرۇلدى. ئاسكوربىك كىسلاتا قۇربانلىق ئېلېكترون بەرگۈچىسى سۈپىتىدە، tert-butaclofen بولسا QB چەكلىگۈچىسى سۈپىتىدە ئاساسلىق RC بەرگۈچىسىنىڭ ئۆلچەش جەريانىدا ئازايتىلغان ھالەتتە تۇرۇشىغا (يەنى فوتوئوكسىدلىنىشقا ئۇچرىماسلىقىغا) كاپالەتلىك قىلىش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدۇ. تەخمىنەن 3 مىللىلىتىر ئەۋرىشكە 2 مىللىمېتىر ئوپتىكىلىق يول ئۇزۇنلۇقىغا ئىگە خاسلاشتۇرۇلغان ئايلىنىدىغان ھۈجەيرىگە (دىئامېتىرى تەخمىنەن 0.1 مېتىر، 350 RPM) قوشۇلۇپ، لازېر يولىدىكى ئەۋرىشكىنىڭ قوزغىتىش ئىمپۇلسلىرى ئارىسىدا قاراڭغۇغا ماسلىشىش ئۈچۈن يېتەرلىك ۋاقىتقا ئىگە بولۇشىغا كاپالەتلىك قىلىنىدۇ. ~100-fs لازېر ئىمپۇلسلىرىنى ئىشلىتىپ، ئەۋرىشكىنى 880 nm دا 1 kHz (NIR ئۈچۈن 20 nJ ياكى Vis ئۈچۈن 100 nJ) تەكرارلاش سۈرئىتىدە قوزغىتىش ئۈچۈن Ti: Sapphire لازېر سىستېمىسى (Spectra Physics, ئامېرىكا) نى كۈچەيتىڭ. سانلىق مەلۇمات توپلاشتىن بۇرۇن، ئەۋرىشكە تەخمىنەن 30 مىنۇت قوزغىتىش نۇرىغا قويۇڭ. ئاشكارىلاش QA نىڭ ئاكتىپسىزلىنىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ (بەلكىم بىر ياكى ئىككى قېتىم QA نى تۆۋەنلىتىشى مۇمكىن). ئەمما بۇ جەرياننىڭ قايتىلىنىدىغانلىقىنى ئۇنتۇپ قالماڭ، چۈنكى ئۇزۇن مەزگىللىك قاراڭغۇ ماسلىشىشتىن كېيىن، RC ئاستا-ئاستا QA پائالىيىتىگە قايتىدۇ. Helios سپېكترومېتىرى (Ultrafast Systems, USA) -10 دىن 7000 ps غىچە بولغان كېچىكىش ۋاقتى بىلەن ئۆتكۈنچى سپېكترلارنى ئۆلچەش ئۈچۈن ئىشلىتىلدى. Surface Xplorer يۇمشاق دېتالىنى (Ultrafast Systems, USA) ئىشلىتىپ، سانلىق مەلۇماتلار توپلىمىنى گۇرۇپپىدىن چىقىرىڭ، ئاندىن بىرلەشتۈرۈڭ ۋە ئۆلچەملەشتۈرۈڭ. بىرلەشتۈرۈلگەن سانلىق مەلۇماتلار توپلىمىنى ئىشلىتىپ پارچىلىنىشقا مۇناسىۋەتلىك پەرقلىق سپېكترلارنى قولغا كەلتۈرۈش ئۈچۈن CarpetView يۇمشاق دېتال بولىقىنى (Light Conversion Ltd., لىتۋا) ئىشلىتىڭ ياكى Origin (OriginLab, USA) دىكى يەككە دولقۇنلۇق سپېكتر تەرەققىياتىغا ماسلىشىش ئۈچۈن كۆپ كۆرسەتكۈچلەرنى ئەسۋاب جاۋابى بىلەن بىرلەشتۈرىدىغان فۇنكسىيەنى ئىشلىتىڭ.
يۇقىرىدا دېيىلگەندەك (53)، RC ۋە پېرىفېرىيەلىك LH2 ئانتېنناسى يوق LH1 بىرىكمىسىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان فوتوسىنتېزلىق پىلاستىنكا تەييارلاندى. پىلاستىنكا 20 mM tris (pH 8.0) بىلەن سۇيۇلدۇرۇلۇپ، ئاندىن 2 مىللىمېتىرلىق ئوپتىكىلىق يولى بار كۋارتس كۇۋېتىغا قاچىلاندى. 30nJ لازېر ئىمپۇلسى ئارقىلىق ئۈلگە 540 nm دا قوزغىتىلدى، كېچىكىش ۋاقتى -10 دىن 7000 ps گىچە بولدى. سانلىق مەلۇماتلار توپلىمىنى Rps. pal ئۈلگىسى ئۈچۈن تەسۋىرلەنگەندەك بىر تەرەپ قىلىڭ.
پەردە 150،000 RCF دا 4 سېلسىيە گرادۇستا 2 سائەت مەركەزدىن قاچۇرۇش ئارقىلىق پارچىلىنىپ، ئاندىن 880 nm دىكى سۈمۈرۈلۈشى 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ۋە 200 mM NaCl دا قايتا ئېرىتىلدى. پەردىنى 4 سېلسىيە گرادۇستا قاراڭغۇ جايدا 1 سائەت 2% (w/v) β-DDM دا ئاستا-ئاستا ئارىلاشتۇرۇپ ئېرىتىڭ. ئەۋرىشكە 100 mM تىرىئېتىلاممونىي كاربونات (pH 8.0) (TEAB؛ Merck، ئەنگىلىيە) دا 2.5 mg ml-1 ئاقسىل قويۇقلۇقىغا سۇيۇلدۇرۇلدى (Bio-Rad ئانالىزى). ئىلگىرى ئېلان قىلىنغان ئۇسۇل (54) بويىچە تېخىمۇ كۆپ پىششىقلاش ئېلىپ بېرىلدى، باشلىنىش نۇقتىسى 50 μg ئاقسىلنى 1% (w/v) ناترىي لاۋرات (Merck، ئەنگىلىيە) تەركىبىدىكى جەمئىي 50 μl TEAB غا سۇيۇلدۇرۇشتىن باشلاندى. 60 سېكۇنت ئۇلترا ئاۋاز دولقۇنى ئارقىلىق تەكشۈرۈلگەندىن كېيىن، ئۇ 5 mM ترىس(2-كاربوكسىئېتىل)فوسفىن (مېرك، ئەنگىلىيە) بىلەن 37 سېلسىيە گرادۇستا 30 مىنۇت قايتا ھاسىل قىلىندى. S-ئالكىللاش ئۈچۈن، ئەۋرىشكە 10 mM مېتىل S-مېتىلتىئومېتانېسۇلفونات (مېرك، ئەنگىلىيە) بىلەن ئىنكۇباتسىيە قىلىنىپ، 200 mM ئىزوپروپانول ئېرىتمىسىدىن ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 10 مىنۇت قوشۇلدى. ئاقسىلنى ئېرىتىش 2 μg ترىپسىن/ئېندوپروتېئىناز Lys-C ئارىلاشمىسى (Promega ئەنگىلىيە) قوشۇش ۋە 37 سېلسىيە گرادۇستا 3 سائەت ئىنكۇباتسىيە قىلىش ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى. لاۋرات سىرتقى يۈز ئاكتىپ ماددىسى 50 μl ئېتىل ئاتسېتات ۋە 10 μl 10% (v/v) LC دەرىجىلىك ترىفلوروئاتسېتىك كىسلاتا (TFA؛ Thermo Fisher Scientific، ئەنگىلىيە) قوشۇش ۋە 60 سېكۇنت ئارىلاشتۇرۇش ئارقىلىق ئېلىندى. باسقۇچ ئايرىش 15700 RCF دا 5 مىنۇت مەركەزدىن قاچۇرۇش ئارقىلىق ئىلگىرى سۈرۈلدى. ئىشلەپچىقارغۇچىنىڭ قائىدىسىگە ئاساسەن، پېپتىد بار تۆۋەنكى باسقۇچنى ئېھتىيات بىلەن سۈمۈرۈپ، تۇزسىزلاندۇرۇش ئۈچۈن C18 ئايلىنىش تۈۋرۈكى (Thermo Fisher Scientific, UK) ئىشلىتىلدى. ۋاكۇئۇم مەركەزدىن قاچۇرۇش ئارقىلىق قۇرۇتۇلغاندىن كېيىن، ئەۋرىشكە %0.5 TFA ۋە %3 ئاتسېتونىترىلدا ئېرىتىلدى، ھەمدە 500 ng ئىلگىرى تەپسىلىي بايان قىلىنغان سىستېما پارامېتىرلىرىنى ئىشلىتىپ، نانو ئېقىمى RP خروماتوگرافىيەسى ۋە ماسسا سپېكترومېتىرىيەسى ئارقىلىق ئانالىز قىلىندى.
Rps. palustris proteome سانلىق مەلۇمات ئامبىرىنى ئىزدەش ئۈچۈن MaxQuant v.1.5.3.30 (56) نى ئىشلىتىپ ئاقسىلنى ئېنىقلاش ۋە مىقدارلاشتۇرۇش ئۈچۈن Rps. palustris proteome سانلىق مەلۇمات ئامبىرىنى ئىزدەڭ (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). ماسسا سپېكترومېتىرىيەسى پروتېئومىكا سانلىق مەلۇماتلىرى PXD020402 سانلىق مەلۇمات توپلىمى ئېنىقلىغۇچ ئاستىدا PRIDE ھەمراھ ئامبىرى (http://proteomecentral.proteomexchange.org) ئارقىلىق ProteomeXchange ئىتتىپاقىغا ساقلاندى.
RPLC ئارقىلىق ئېلېكترو پۈركۈش ئىئونلاشتۇرۇش ماسسا سپېكترومېتىرىيەسى بىلەن بىرلەشتۈرۈلگەن ئانالىز قىلىش ئۈچۈن، RC-LH1 بىرىكمىسى ياۋا تىپتىكى Rps دىن تەييارلاندى. ئىلگىرى ئېلان قىلىنغان ئۇسۇل (16) ئارقىلىق، 20 mM Hepes (pH 7.8)، 100 mM NaCl ۋە 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad ئانالىزى) ) DDM دا پالۇستىرىس ھۈجەيرىلىرىدە ھاسىل بولغان ئاقسىلنىڭ قويۇقلۇقى 2 mg ml-1 بولدى. ئىشلەپچىقارغۇچىنىڭ قائىدىسىگە ئاساسەن، 2D تازىلاش ئۈسكۈنىسى (GE Healthcare, USA) ئارقىلىق 10 μg ئاقسىلنى چۆكمە ئۇسۇلى بىلەن ئايرىۋېلىڭ ۋە چۆكمىنى 20 μl 60% (v / v) فورمىك كىسلاتا (FA)، 20% (v / v) ئاتسېتونىترىل ۋە 20% (v/v) سۇدا ئېرىتىڭ. بەش مىكرولىتىر RPLC (Dionex RSLC) ئارقىلىق ماسسا سپېكترومېتىرىيەسى (Maxis UHR-TOF, Bruker) بىلەن بىرلەشتۈرۈلگەن ئانالىز قىلىندى. MabPac 1.2×100 مىللىمېتىرلىق ئىستون (Thermo Fisher Scientific, UK) نى ئىشلىتىپ، 60 سېلسىيە گرادۇستا ۋە 100μlmin -1 دا ئايرىڭ، بۇ ئىستوننىڭ گرادۇسى %85 (v / v) ئېرىتكۈچى A [%0.1 (v / v) FA ۋە %0.02 (V/v) TFA سۇ ئېرىتمىسى] دىن %85 (v/v) ئېرىتكۈچى B [%0.1 (v / v) FA ۋە %0.02 (v/v) 90% (v/v) ئاتسېتونىترىل TFA] غىچە بولىدۇ. ئۆلچەملىك ئېلېكترو پۈركۈش ئىئونلىشىش مەنبەسى ۋە ئۆزلۈكىدىن تەڭشەلگەن پارامېتىرلارنى 60 مىنۇتتىن ئارتۇق ئىشلىتىپ، ماسسا سپېكترومېتىرى 100 دىن 2750 m/z غىچە (ماسسا-زەرەد نىسبىتى) گە ئېرىشىدۇ. ExPASy بىئوئىنفورماتىكا بايلىق پورتالى FindPept قورالى (https://web.expasy.org/findpept/) نىڭ ياردىمىدە، ماسسا سپېكترىنى مۇرەككەپ بىرلىكنىڭ تارماق بىرلىكلىرىگە خەرىتىلەڭ.
ھۈجەيرىلەر 100 مىللىلىتىرلىق NF-تۆۋەن (10μMm-2 s-1)، ئوتتۇرا (30μMm-2 s-1) ياكى يۇقىرى (300μMm-2 s-1) يورۇقلۇق ئاستىدا 72 سائەت ئۆستۈرۈلدى. M22 مۇھىتى (ئاممونىي سۇلفات قوشۇلمىغان ۋە ناترىي سۇكسىنات ناترىي ئاتسېتات بىلەن ئالماشتۇرۇلغان M22 مۇھىتى) 100 مىللىلىتىرلىق بۇرمىلىق ئۈستىدىكى بوتۇلكىدا (23). بەش 30 سېكۇنتلۇق دەۋرىيلىكتە، 0.1 مىكرونلۇق ئەينەك مارجانلار 1:1 ھەجىم نىسبىتىدە ھۈجەيرىلەرنى ئېرىتىش ئۈچۈن مونچاق قىلىنىپ، مۇز ئۈستىدە 5 مىنۇت سوۋۇتۇلدى. ئېرىمەيدىغان ماددىلار، سۇنۇپ كەتمىگەن ھۈجەيرىلەر ۋە ئەينەك مارجانلار ئۈستەل يۈزىدىكى مىكرو مەركەزدىن قاچۇرۇش ماشىنىسىدا 16000 RCF دا 10 مىنۇت مەركەزدىن قاچۇرۇش ئارقىلىق چىقىرىۋېتىلدى. پەردە Ti 70.1 روتورىدا 100،000 RCF بىلەن 20 mM tris-HCl (pH 8.0) دا 40/15% (w/w) ساخاروزا گرادىيېنتى بىلەن 10 سائەت ئايرىلدى.
ئالدىنقى ئەسەرلىرىمىزدە بايان قىلىنغاندەك، PufW (16) دىكى His بەلگىسىنىڭ ئىممۇنىتېت تەكشۈرۈشى. قىسقىسى، 2x SDS يۈكلەش بۇففېرىدا (Merck, ئەنگىلىيە) تازىلانغان يادرولۇق مۇرەككەپ بىرىكمە (11.8 nM) ياكى ئوخشاش قويۇقلۇقتىكى RC نى ئۆز ئىچىگە ئالغان پەردە (ئوكسىدلىنىش ئارقىلىق ئازايتىلغان پەرق سپېكتىرىنى چىقىرىۋېتىش ۋە بوялغان گېلدىكى يۈكنى ماسلاشتۇرۇش ئارقىلىق بېكىتىلىدۇ) ئىككى قېتىم سۇيۇلدۇرۇلدى. ئاقسىللار 12% bis-tris NuPage گېلىنىڭ كۆچۈرمىسىدە (Thermo Fisher Scientific, ئەنگىلىيە) ئايرىلدى. RC-L تارماق بىرلىكىنى يۈكلەش ۋە كۆرسىتىش ئۈچۈن بىر گېل Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, ئەنگىلىيە) بىلەن بوялدى. ئىككىنچى گېلدىكى ئاقسىل ئىممۇنىتېت تەكشۈرۈشى ئۈچۈن مېتانول بىلەن ئاكتىپلاشتۇرۇلغان پولىۋىنىلىدىن فلۇئورىد (PVDF) پەردىسىگە (Thermo Fisher Scientific, ئەنگىلىيە) يۆتكەلدى. PVDF پەردىسى 50 mM tris-HCl (pH 7.6)، 150 mM NaCl، 0.2% (v / v) Tween-20 ۋە 5% (w / v) قايماقسىز سۈت پاراشوكىدا توسۇلۇپ، ئاندىن HIS غا قارشى ئاساسلىق ئانتىتېلا بىلەن (سۇيۇلدۇرۇلغان ئانتىتېلا بۇفېرى [50 mM tris-HCl (pH 7.6)، 150 mM NaCl ۋە 0.05% (v/v) Tween-20] 1:1000 A190-114A دا، Bethyl Laboratories، ئامېرىكا) 4 سائەت ئىنكۇباتسىيە قىلىندى. ئانتىتېلا بۇفېردا 3 قېتىم 5 مىنۇت يۇيغاندىن كېيىن، پەردە ئات پېروكسىدازا (Sigma-Aldrich، ئەنگىلىيە) چاشقانغا قارشى ئىككىنچى دەرىجىلىك ئانتىتېلا (ئانتىتېلا بۇفېردا 1:10،000 سۇيۇلدۇرۇلغان) بىلەن بىرلەشتۈرۈلدى. WESTAR ETA C 2.0 خېمىلۇمىنېسسېنسىيە سۇبستراتىسى (Cyanagen، ئىتالىيە) ۋە Amersham Imager 600 (GE Healthcare، ئەنگىلىيە) ئارقىلىق بايقاش ئۈچۈن (ئانتىتېلا بۇفېردا 3 قېتىم يۇيغاندىن كېيىن 5 مىنۇت) ئىنكۇباتسىيە قىلىندى.
ImageJ (57) دا ھەر بىر بوялغان گېل ياكى ئىممۇنىتېت سىنىقى يولىنىڭ كۈچلۈكلۈك تەقسىملىنىشىنى سىزىپ، چوققا ئاستىدىكى رايوننى بىرلەشتۈرۈپ، RC-L (بوялغان گېل) ۋە Protein-W (ئىممۇنىتېت سىنىقى) نىڭ كۈچلۈكلۈك نىسبىتىنى ھېسابلاپ، رەسىمنى بىر تەرەپ قىلىڭ. بۇ نىسبەتلەر ساپ RC-LH114-W ئەۋرىشكىسىدىكى RC-L نىڭ Protein-W غا بولغان نىسبىتى 1:1 دەپ پەرەز قىلىش ۋە شۇنىڭغا ئاساسەن پۈتۈن سانلىق مەلۇماتلارنى نورماللاشتۇرۇش ئارقىلىق مولار نىسبىتىگە ئايلاندۇرۇلدى.
بۇ ماقالىگە ئائىت قوشۇمچە ماتېرىياللار ئۈچۈن، http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 گە قاراڭ.
بۇ ماقالە Creative Commons Attribution License شەرتلىرى بويىچە تارقىتىلغان ئوچۇق كىرىشلىك ماقالە. بۇ ماقالە ئەسلى ئەسەرنىڭ توغرا نەقىل كەلتۈرۈلۈشى شەرتى بىلەن ھەر قانداق ۋاسىتە ئارقىلىق چەكلىمىسىز ئىشلىتىش، تارقىتىش ۋە كۆپەيتىشكە يول قويۇلىدۇ.
ئەسكەرتىش: بىز پەقەت ئېلخەت ئادرېسىڭىزنى بېرىشىڭىزنى تەلەپ قىلىمىز، شۇنداق بولغاندا بەتكە تەۋسىيە قىلغان كىشى ئېلخەتنى كۆرۈشنى خالايدىغانلىقىڭىزنى ۋە ئۇنىڭ ئەخلەت ئەمەسلىكىنى بىلىدۇ. بىز ھېچقانداق ئېلخەت ئادرېسىنى خاتىرىلىمەيمىز.
بۇ سوئال سىزنىڭ زىيارەتچى ئىكەنلىكىڭىزنى سىناش ۋە ئاپتوماتىك ھالدا ئەخلەت ئۇچۇر يوللاشنىڭ ئالدىنى ئېلىش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدۇ.
داۋىد JK سۋاينسبۇرى، پارك چىئان، فىلىپ J. جېكسون، كەيتلىن م. فايرىس، دارىئۇس م. نىدزۋىدزكى، ئېلىزابېت C. مارتىن، داۋىد A. ​​فارمېر، لورنا A. مالون، رېبېككا F. تومپسون، نېل A. رانسون، دانىيال P كاننىففې، مارك J. دىكمان، دېۋېي خولتېن، كىرىستىن كىرمايېر، ئاندرېۋ خىچكوك، C. نېل ھانتېر
رېئاكسىيە مەركىزىدىكى 1-نومۇرلۇق نۇر تۇزاق بىرىكمىسىنىڭ يۇقىرى ئېنىقلىقتىكى قۇرۇلمىسى خىنون دىنامىكىسىغا يېڭىچە چۈشەنچە بېرىدۇ.
داۋىد JK سۋاينسبۇرى، پارك چىئان، فىلىپ J. جېكسون، كەيتلىن م. فايرىس، دارىئۇس م. نىدزۋىدزكى، ئېلىزابېت C. مارتىن، داۋىد A. ​​فارمېر، لورنا A. مالون، رېبېككا F. تومپسون، نېل A. رانسون، دانىيال P كاننىففې، مارك J. دىكمان، دېۋېي خولتېن، كىرىستىن كىرمايېر، ئاندرېۋ خىچكوك، C. نېل ھانتېر
رېئاكسىيە مەركىزىدىكى 1-نومۇرلۇق نۇر تۇزاق بىرىكمىسىنىڭ يۇقىرى ئېنىقلىقتىكى قۇرۇلمىسى خىنون دىنامىكىسىغا يېڭىچە چۈشەنچە بېرىدۇ.
© 2021 ئامېرىكا ئىلىم-پەننى ئىلگىرى سۈرۈش جەمئىيىتى. بارلىق ھوقۇقلار قوغدىلىدۇ. AAAS بولسا HINARI ، AGORA ، OARE ، CHORUS ، CLOCKSS ، CrossRef ۋە COUNTER نىڭ ھەمكارلاشقۇچىسى. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.